多房棘球蚴Em95基因克

发布时间：2017-04-18 11:11

  本文关键词：多房棘球蚴Em95基因克隆、原核表达及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：多房棘球蚴病俗称泡球蚴病是由多房棘球绦虫的幼虫(多房棘球蚴、泡球蚴)寄生于人或动物肝脏所引起的一种人兽共患寄生虫病,它的成虫主要寄生于狐狸、狼和犬的小肠内。本病主要在北半球高纬度地区和冻土地带流行,但随着世界贸易和全球化进程的推进,该病有向南半球蔓延的趋势。它不仅能严重危害人体的健康,而且还是一个严重的社会经济问题。目前,对于该病的治疗主要是以手术切除为主,药物治疗为辅,但是由于泡球蚴呈肿瘤样无限浸润生长,手术切除后能发生转移,因此对泡球蚴病的预防成为流行区各级政府所优先关心的问题。研究多房棘球绦虫保护性抗原EM95的免疫保护作用对泡球蚴病疫苗研制与开发具有十分重要的意义。本研究以NCBI数据库Em95基因序列作为参考序列设计引物,以多房棘球蚴总RNA反转录产物为模板进行PCR扩增,获得Em95基因完整ORF序列,并对该序列进行了相关的生物信息学分析。结果表明,EM95蛋白的编码基因长471 bp,与参考序列的相似性为100%,由156个氨基酸残基组成,其上有2个N-糖基化位点,N端有一长为16个氨基酸的信号肽序列,C端有由23个氨基酸组成的跨膜区,属于分泌型糖蛋白。B细胞抗原表位分析表明,EM95有6个潜在的抗原表位,比EG95预测的抗原表位少一个。将全长的Em95基因和截去编码信号肽及跨膜区的Em95基因分别克隆到原核表达载体中并转化到大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用IPTG诱导使其表达。结果表明,全长的Em95基因以包涵体形式表达,而截去信号肽及跨膜区的Em95基因(t Em95)以可溶性蛋白形式表达。将纯化后的tEM95重组蛋白免疫BALB/c小鼠(雌性,6周龄),小鼠分为免疫组(首免50μg,以后减半,40只)、佐剂组(40只)和对照组(40只),三次免疫两周后腹腔接种多房棘球蚴原头蚴(100个/只)进行攻击感染,9周后对试验小鼠进行剖检,结果表明EM95重组蛋白对小鼠的保护率为27.58%,减蚴率为60.52%~67.38%。结论认为,EM95重组蛋白对继发性多房棘球蚴病具有一定的保护作用,能明显抑制多房棘球蚴的生长;本研究为多房棘球蚴病EM95重组抗原疫苗的研制和开发提供了理论依据。
【关键词】：多房棘球绦虫 EM95重组蛋白 基因克隆与表达 疫苗 免疫保护作用
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.7;Q78
【目录】：

• 附件2-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 前言13-19
• 1.1 包虫病/棘球绦虫13-14
• 1.2 泡型包虫病/多房棘球蚴14-16
• 1.3 EG95/EM9516-19
• 第二章 多房棘球绦虫Em95基因克隆及序列分析19-26
• 2.1 材料与方法19-21
• 2.1.1 多房棘球蚴、菌种及试剂19
• 2.1.2 引物设计与合成19
• 2.1.3 多房棘球蚴的获取19-20
• 2.1.4 原头蚴总RNA提取与反转录20
• 2.1.5 PCR扩增多房棘球蚴Em95基因20
• 2.1.6 Em95基因的克隆及测序20
• 2.1.7 Em95基因序列分析20-21
• 2.2 结果21-25
• 2.2.1 多房棘球蚴总RNA的提取21
• 2.2.2 多房棘球绦虫Em95基因的克隆21-22
• 2.2.3 EM95理化性质22-23
• 2.2.4 EM95信号肽及跨膜区预测23
• 2.2.5 EM95二级结构分析23-24
• 2.2.6 抗原表位预测24
• 2.2.7 三级结构预测24-25
• 2.3 讨论25-26
• 第三章 多房棘球绦虫Em95基因原核表达载体的构建及表达26-34
• 3.1 实验材料26
• 3.1.1 载体与菌株26
• 3.1.2 主要试剂26
• 3.1.3 主要仪器26
• 3.2 实验方法26-28
• 3.2.1 重组质粒的构建及鉴定26-27
• 3.2.2 多房棘球蚴EM95的原核表达及表达形式鉴定27-28
• 3.2.3 表达条件优化28
• 3.2.4 重组EM95蛋白纯化28
• 3.3 结果28-32
• 3.3.1 Em95基因片段的扩增28-29
• 3.3.2 重组质粒阳性鉴定（PCR）29
• 3.3.3 Em95和tEm95原核表达29-30
• 3.3.4 pET30a-tEm95重组蛋白诱导条件的优化30-31
• 3.3.5 pET30a-tEm95重组蛋白的纯化31-32
• 3.4 讨论32-34
• 第四章 重组EM95蛋白免疫小鼠保护力观察及应用34-41
• 4.1 材料与方法34-36
• 4.1.1 实验动物、多房棘球蚴及样品34
• 4.1.2 主要试剂及溶液34
• 4.1.3 小鼠的免疫实验34-35
• 4.1.4 ELISA检测EM95特异性抗体检测35
• 4.1.5 EM95重组蛋白保护效力观察35
• 4.1.6 EM95重组蛋白的应用35-36
• 4.2 结果36-39
• 4.2.1 ELISA检测36-37
• 4.2.2 攻虫实验37
• 4.2.3 EM95重组蛋白保护力检测37-38
• 4.2.4 EM95重组蛋白的应用38-39
• 4.3 讨论39-41
• 第五章 全文结论41-42
• 参考文献42-47
• 致谢47-48
• 作者简历48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：314742