核酸恒温扩增技术检测结核分枝杆菌的比较研究

发布时间：2017-04-19 18:06

  本文关键词：核酸恒温扩增技术检测结核分枝杆菌的比较研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种人畜共患传染病,结核分枝杆菌是人和动物结核病的主要病原。人结核病和动物结核病是可以相互传染的,人类的结核病可以通过呼吸或飞沫传给人或其他动物,动物结核病除了通过呼吸或飞沫外,还可以通过一些动物产品如肉、奶、蛋等畜产品进行传播。目前,最为常见的动物结核就是牛结核病,它不仅给畜牧业带来严重的影响,并且给人类的健康安全也造成了很大的威胁。近年来,人结核病的发病率明显上升,特别是儿童肠结核的发病率明显增加,有报道显示,从这些儿童患者中分离的30%的菌株为牛分枝杆菌。结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段,同时也是确定结核病诊断、切断传播途径并制定治疗方案的重要依据。由于传统的检测方法不够完善,如检测时间长、灵敏性与特异性不高、对设备要求高等。因此,建立快速、准确、灵敏、价格低廉的结核病实验室诊断方法对结核病控制有着极为重要的意义。目的:建立一种快速、准确、价格低廉易于临床推广的,并可以运用于畜产品中结核分枝杆菌检测的方法。方法:通过优化环介导等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与RNA恒温扩增实时检测技术(Simultaneous amplification and testing,SAT)的反应条件与体系,建立起两种可以用于牛乳中结核分枝杆菌检测的核酸扩增方法。本实验通过对牛奶中结核分枝杆菌的DNA和RNA的提取方法以及对每种方法的反应体系、反应温度、反应时间进行优化,并对牛乳中结核分枝杆菌检测的灵敏度、特异性、重复性进行检测,确定这两种方法对牛乳中结核分枝杆菌的最低检测浓度(灵敏度)。同时还将环介导等温扩增技术与RNA恒温扩增实时检测技术同结核罗氏培养技术、抗酸染色镜检、PCR技术进行比较,评价与分析各种检测方法对牛乳中结核分枝杆菌的检测结果,以确定最佳检测方法,为临床应用提供参考依据。结果:环介导等温扩增技术和RNA恒温扩增实时检测技术的灵敏度、特异性、重复性都比较高,对牛乳中结核分枝杆菌的最低检测浓度分别为3×101CFU/m L和3×100 CFU/m L。RNA恒温扩增实时检测技术的灵敏度要明显高于环介导恒温扩增技术,并且是它的10倍。牛乳中结核分枝杆菌的DNA与RNA的提取方法分别为改良后的CTAB/NACL法与改良后的手工提取RNA法。结核培养技术、抗酸镜检、PCR技术对牛乳中结核分枝杆菌的检测的最低浓度分别为3×105 CFU/m L、3×108 CFU/m L、3×104 CFU/m L。结论:建立的环介导等温扩增技术与RNA恒温扩增实时检测技术可用于牛乳中结核分枝杆菌的检测,这两种方法操作简单,对实验仪器要求不高,易于在产品检验与检疫中应用。与结核培养技术、抗酸涂片镜检技术、PCR技术相比,对牛乳中的结核分枝杆菌的检测浓度更低,灵敏度更高,RNA恒温扩增实时检测技术的灵敏度要比环介导等温扩增技术高10倍。
【关键词】：结核分枝杆菌 16SRNA 牛奶 核酸恒温扩增
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 英文缩略词表13-14
• 前言14-15
• 第一章 文献综述15-27
• 1 结核病的流行情况15-17
• 1.1 人结核病的流行情况与现状15-16
• 1.2 牛结核病的流行现状与趋势16-17
• 2 结核病的发病率大幅上升的原因17-19
• 2.1 HIV与TB的双重感染17-18
• 2.2 耐多药结核分枝杆菌的散播18
• 2.3 BCG免疫效果降低18-19
• 2.4 人.的大规模流动19
• 2.5 诊断方法落后、耗费大19
• 3 结核病的实验室诊断技术19-27
• 3.1 细菌学诊断新技术19-21
• 3.1.1 以涂片为基础的诊断技术19-20
• 3.1.2 以培养为基础的诊断新技术20-21
• 3.2 免疫学诊断21-23
• 3.2.1 结核菌素皮肤实验（TST）21
• 3.2.2 淋巴细胞分泌抗体的（ALS）检测21-22
• 3.2.3 γ 干扰素检测（IGRA）22
• 3.2.4 隐性结核感染的Quanti FERON血液学检测22-23
• 3.2.5 ELISpot即酶联免疫斑点法23
• 3.3 分子生物学诊断23-27
• 3.3.1 聚合酶链反应（PCR）23
• 3.3.2 直接测序技术23
• 3.3.3 基因芯片技术23-24
• 3.3.4 Xpert MTB/RIF检测技术24
• 3.3.5 环介导恒温扩增技术24
• 3.3.6 RNA扩增技术24-27
• 第二章 实验部分27-60
• 实验一 环介导等温扩增法对结核分枝杆菌检测条件的优化27-36
• 摘要27
• 1 材料与方法27-30
• 1.1 材料27-28
• 1.1.1 菌株28
• 1.1.2 主要试剂28
• 1.2 方法28-30
• 1.2.1 细菌培养以及DNA模板的制备28
• 1.2.2 PCR检测28
• 1.2.3 LAMP实验的引物28-29
• 1.2.4 LAMP反应体系与反应条件29
• 1.2.5 LAMP检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性29
• 1.2.6 人工人工阳性乳中结核分枝杆菌基因组DNA的提取方法比较29-30
• 1.2.7 LAMP检测结核分枝杆菌人工阳性乳的最低检测浓度30
• 2 结果30-34
• 2.1 LAMP检测方法的建立30
• 2.2 LAMP反应体系与反应程序的优化30-31
• 2.3 LAMP扩增技术灵敏度的检测31
• 2.4 LAMP特异性实验31-32
• 2.5 人工人工阳性乳中结核分枝杆菌DNA的提取32-33
• 2.6 人工人工阳性乳中LAMP的最低检测浓度33-34
• 3 讨论34-35
• 4 小结35-36
• 实验二 RNA恒温扩增实时检测技术检测牛奶中结核分枝杆菌的研究36-50
• 摘要36
• 1 材料和方法36-42
• 1.1 材料36-39
• 1.1.1 实验菌株36-37
• 1.1.2 主要仪器设备37
• 1.1.3 实验用培养基和实验重要试剂的配制37-39
• 1.2 方法39-42
• 1.2.1 无菌牛奶的制备39
• 1.2.2 结核分枝杆菌菌悬液的制备39
• 1.2.3 模板的制备39-40
• 1.2.4 SAT检测40
• 1.2.5 SAT反应体系的优化40
• 1.2.6 SAT特异性、敏感性、重复性的检测40-41
• 1.2.7 人工阳性乳的制备41
• 1.2.8 人工阳性乳中结核分枝杆菌总RNA提取41-42
• 1.2.9 SAT检测结核分枝杆菌人工阳性乳特异性实验42
• 1.2.10 SAT检测结核分枝杆菌人工阳性乳敏感性实验42
• 1.2.11 SAT检测结核分枝杆菌人工阳性乳重复性实验42
• 2. 结果42-47
• 2.1 SAT检测的优化结果42
• 2.2 SAT特异性实验结果42-43
• 2.3 敏感性实验的检测结果43-44
• 2.4 重复性实验结果44
• 2.5 对人工阳性乳的检测结果44-47
• 2.5.1 人工阳性乳模板的制备44-46
• 2.5.2 人工阳性乳模板SAT扩增结果46
• 2.5.3 人工阳性乳的SAT特异性实验结果46-47
• 2.5.4 人工阳性乳的SAT敏感性实验结果47
• 2.5.5 人工阳性乳的SAT重复性实验结果47
• 3 讨论47-48
• 4 小结48-50
• 实验三 几种不同检测牛奶中结核分枝杆菌方法的比较50-60
• 摘要50
• 1 材料与方法50-53
• 1.1 材料50-51
• 1.1.1 实验菌株50
• 1.1.2 主要实验仪器与设备50-51
• 1.1.3 主要试剂的配制51
• 1.2 方法51-53
• 1.2.1 菌悬液的制备51-52
• 1.2.2 人工阳性乳的制备52
• 1.2.3 罗氏培养法检测52
• 1.2.4 抗酸染色镜检52
• 1.2.5 PCR法检测52-53
• 1.2.6 LAMP法检测53
• 1.2.7 SAT法53
• 1.2.8 比较五种检测方法检测结果53
• 2 结果53-58
• 2.1 罗氏培养法检测人工阳性乳中结核分枝杆菌的结果53-54
• 2.2 抗酸染色镜检人工阳性乳中结核分枝杆菌的结果54-55
• 2.3 PCR检测人工阳性乳中结核分枝杆菌的结果55
• 2.4 LAMP法扩增检测结核分枝杆菌人工阳性乳的结果55-56
• 2.5 SAT法检测人工阳性乳中结核分枝杆菌的结果56-57
• 2.6 评价分析几种检测方法的结果57-58
• 3 讨论58-59
• 4 小结59-60
• 创新点60-61
• 参考文献61-67
• 致谢67-68
• 作者简介68-69
• 导师评阅表69

【参考文献】

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本文编号：316827