日本对虾MCM7克隆及其调控细胞吞噬作用的研究

发布时间：2017-04-20 02:18

  本文关键词：日本对虾MCM7克隆及其调控细胞吞噬作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：微染色体维持蛋白(Minichromosome Maintenance Protein, MCM7)隶属于MCM蛋白家族,在真核生物中高度保守,参与MCMs复合体作为细胞复制周期的许可证和染色体复制起始因子。使用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)从日本对虾(Marsupenaeus Japonicus)中克隆得到全长为2307bp的cDNA序列,分析显示该基因拥有1974bp大小的开放阅读框,编码一个658aa蛋白,基因含有Poly(A)尾,5’和3’的非编码区分别为139bp和191bp,蛋白序列BLAST发现同源性高于75%,进化树分析显示该基因在真核动物中高度保守,与鱼类与爪蟾享有较近亲缘关系。检测基因表达的组织特异性发现MCM7表达在免疫器官包括血淋巴及肝胰腺中较高,消化腺内表达水平次之,而在心脏、肌肉、鳃和后肠等组织内表达量较低。进一步研究发现,感染对虾白班综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)后,MCM7基因出现过表达。通过小RNA干扰技术(Short Interfering RNA, siRNA),设计并体外合成的siRNA注射处理对虾,成功敲低MCM7的表达。实时荧光定量检测发现基因表达水平降低后,对虾先天性免疫系统中多个重要基因受到影响,其中hemocyanin, proPO, TNF和P-actin的表达量上调,而细胞骨架蛋白调控基因如myosin, Rho的表达量则下调,则表明MCM7的表达对细胞吞噬作用有影响。通过RNAi技术抑制MCM7表达后,发现细胞吞噬率降低,表明MCM7对细胞吞噬有调控作用。并且MCM7表达被抑制后WSSV病毒的拷贝数上升,表明MCM7调控的细胞吞噬作用可能有利于抑制病毒复制。本研究首次在甲壳动物中成功克隆MCM7,并揭示了MCM7在血细胞吞噬进程中的角色,为甲壳动物先天性免疫的进一步研究提供了新的线索。
【关键词】：日本对虾 MCM7 分子克隆 对虾白斑病毒 先天性免疫 细胞吞噬
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 引言8-14
• 1 日本对虾MCM7基因全长序列的克隆14-30
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 日本对虾14
• 1.1.2 试剂与溶液14
• 1.1.3 仪器与设备14-15
• 1.2 实验方法15-23
• 1.2.1 样品制备15
• 1.2.2 RNA提取15
• 1.2.3 快速扩增cDNA末端(RACE)15-16
• 1.2.4 3’RACE16-18
• 1.2.5 5’RACE18-19
• 1.2.6 序列拼接19-21
• 1.2.7 克隆与测序21-22
• 1.2.8 测序结果分析22-23
• 1.3 结果分析23-29
• 1.3.1 3’序列23-24
• 1.3.2 5’序列24-25
• 1.3.3 全长序列拼接与分析25-29
• 1.4 讨论29
• 1.5 小结29-30
• 2 日本对虾MCM7基因的表达与抑制30-43
• 2.1 材料30-31
• 2.1.1 日本对虾30
• 2.1.2 WSSV粗提取30
• 2.1.3 试剂与溶液30
• 2.1.4 仪器与设备30-31
• 2.2 实验方法31-37
• 2.2.1 实验材料处理31
• 2.2.2 RNA提取与cDNA合成31-32
• 2.2.3 实时荧光定量检测32-33
• 2.2.4 结果分析33
• 2.2.5 siRNA干扰设计33-35
• 2.2.6 体内siRNA干扰试验35-36
• 2.2.7 体外siRNA干扰试验36-37
• 2.3 结果分析37-41
• 2.3.1 MCM7组织表达差异性与病原诱导表达变化分析37-38
• 2.3.2 siRNA体内试验干扰MCM7表达38-39
• 2.3.3 siRNA体外试验干扰MCM7表达39-41
• 2.4 讨论41-42
• 2.5 小结42-43
• 3 MCM7基因在日本对虾免疫系统中的作用43-58
• 3.1 材料43
• 3.1.1 日本对虾血细胞培养43
• 3.1.2 试剂与溶液43
• 3.1.3 仪器与设备43
• 3.2 实验方法43-48
• 3.2.1 siRNA敲低处理43
• 3.2.2 实时荧光定量检测各通路基因变化43-44
• 3.2.3 WSSV提取与纯化44-45
• 3.2.4 细胞培养观察试验45
• 3.2.5 病毒拷贝数试验45-46
• 3.2.6 死亡率(mortality)试验46-47
• 3.2.7 吞噬试验47-48
• 3.3 结果分析48-56
• 3.3.1 细胞培养观察结果48-50
• 3.3.2 MCM7对其他主要免疫通路与免疫因子的影响50-52
• 3.3.3 MCM7对病毒入侵的影响52-54
• 3.3.4 MCM7对吞噬作用的影响54-56
• 3.4 讨论56-57
• 3.5 小结57-58
• 结论58-60
• 参考文献60-64
• 个人简介64-65
• 致谢65

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1 王徵;日本对虾MCM7克隆及其调控细胞吞噬作用的研究[D];浙江农林大学;2015年

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本文编号：317700