马疱疹病毒1型神经致病因子UL24基因转录调控机制的研究

发布时间：2017-04-20 05:07

  本文关键词：马疱疹病毒1型神经致病因子UL24基因转录调控机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：马疱疹病毒1型(Equine Herpesvirus 1,EHV-1)为引起马属动物流产、瘫痪、共济失调、神经性脑脊髓炎的主要病原。EHV-1主要编码6种调控蛋白,包括1个极早期蛋白(IE)、4个早期蛋白(IR2、EICP0、EICP22、EICP27)以及1个晚期蛋白(ETIF)。这些蛋白对自身病毒基因的转录调控起着关键作用。EHV-1的76个基因中,启动子结构明确的只有8个,分别为gK、IR5、IE、IR2、EICP0、EICP22、EICP27和ETIF,EHV-1调控蛋白对自身启动子调控特征的研究更是十分有限。UL24基因在所有疱疹病毒科中高度保守性,其编码的蛋白与神经致病性密切相关。EHV-1神经系统条件性致病依赖于病毒自身对UL24基因转录的调控。目前,EHV-1 UL24基因转录调控的相关研究还未见报道,本研究以马疱疹病毒1型(EHV-1)UL24基因(ORF37)为研究对象,研究UL24启动子在EHV-1基因组中的精确定位以及UL24基因转录调控的分子机制等科学问题。本研究中,利用5′RACE方法,确证了UL24开放阅读框上游的两个转录起始位点Tss1和Tss2,分别定位于基因组70118 bp和70397 bp;根据转录起始位点所在基因序列特征,构建UL24启动子报告重组质粒(pUL24I、pUL24II-1、pUL24II-2、pUL24II-3、pUL24II-4、pUL24II-5、pUL24II-6、pUL24II-7、pUL24II-8),利用双荧光素酶报告检测系统确证了UL24I与UL24II-5分别为Tss1和Tss2对应的启动子,且二者所含核心元件不同,分别为TATA盒子和起始子(INR);同时克隆EHV-1调控蛋白基因,构建真核表达重组质粒(pIE、pIR2、pEICP0、pEICP22、pEICP27、pEICP27-Flag、pETIF),经Western blotting检测,验证了EHV-1调控蛋白的表达;为了检测调控蛋白对UL24启动子活性的影响,我们通过共转染UL24启动子报告重组质粒与调控蛋白真核表达重组质粒,利用双荧光素酶报告检测系统进行检测,结果表明:EHV-1六种调控蛋白对UL24的不同的启动子调控模式相似,启动子UL24I和UL24II-5在EICP0蛋白作用下,活性分别升高2.3倍和17.5倍;在EICP22蛋白作用下,活性分别升高2.4倍和6倍;在ETIF蛋白作用下,活性分别升高1.8倍和4倍。与之相反,启动子UL24I和UL24II-5在IR2蛋白作用下,活性分别下降43.4倍和26.3倍;在IE蛋白作用下,活性分别下降2.3倍和3.9倍;EICP22可与IE蛋白协同增强UL24I启动子活性。同时,本研究利用免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术,以EICP27蛋白为参照,探索EICP22蛋白增强UL24启动子活性的机制,结果表明,EICP22蛋白增强UL24启动子活性不依赖于EICP22蛋白与转录因子TBP间的相互作用。本研究结果揭示了UL24基因转录调控方面的新机制,为后续神经条件性致病机理研究提供理论线索和实验依据。
【关键词】：马疱疹病毒1型 转录调控 神经致病因子 UL24
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 马鼻肺炎概述11-15
• 1.1.1 马鼻肺炎11
• 1.1.2 马疱疹病毒1型11-15
• 1.2 基因的转录调控概述15-16
• 1.3 疱疹病毒UL24的研究16-17
• 1.3.1 UL24基因序列的特点16
• 1.3.2 UL24基因编码蛋白的特点16-17
• 1.4 研究的目的与意义17-19
• 第二章 马疱疹病毒UL24基因转录调控的研究19-36
• 2.1 材料和方法19-25
• 2.1.1 细胞培养和病毒19
• 2.1.2 质粒和菌株19
• 2.1.3 主要试剂19-20
• 2.1.4 主要设备仪器20
• 2.1.5 细胞总RNA的提取20-21
• 2.1.6 UL24 cDNA 5?末端全长的扩增21
• 2.1.7 病毒DNA的提取21
• 2.1.8 引物的设计及重组质粒的构建21-24
• 2.1.9 Western bloting24
• 2.1.10 双萤光素酶报告系统24
• 2.1.11 激光共聚焦24-25
• 2.1.12 免疫共沉淀25
• 2.2 结果25-33
• 2.2.1 UL24转录起始位点的确定25-26
• 2.2.2 UL24启动子活性的鉴定26-27
• 2.2.3 UL24启动子元件的鉴定27-29
• 2.2.4 EHV-1 调控蛋白的表达29
• 2.2.5 调控蛋白对UL24启动子活性的影响29-30
• 2.2.6 调控蛋白EICP22、EICP27、IE对启动子活性的影响30-31
• 2.2.7 调控蛋白EICP22、EICP27分别与TBP的免疫共沉淀31-32
• 2.2.8 调控蛋白EICP22、EICP27分别与TBP的共定位32-33
• 2.3 讨论33-36
• 第三章 全文结论36-37
• 参考文献37-43
• 致谢43-44
• 作者简历44

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