利用TaLEC基因建立小麦再生体系和创制小麦大粒新种质

发布时间：2021-05-15 08:00

　　小麦（Triticum aestivum L.）是世界三大粮食作物之一。农杆菌介导的遗传转化是小麦基因功能研究的主要手段,但较低的植物再生能力限制了高效遗传转化体系的建立,阻碍了小麦功能基因组学分析和基因工程育种的有效开展。建立高效的再生体系对于小麦高效遗传转化和基因功能研究具有重要意义。本研究从小麦中克隆了转录因子LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）和LEC2的同源基因并进行了进化树和时空表达模式分析,进而对该基因在小麦中的生物学功能进行了研究。主要结果如下:本研究用拟南芥LEC2的全长氨基酸序列,在Ensembl Plants数据库中进行BLAST检索。结果表明,TaLEC2基因位于3号染色体上。以中国春和Fielder的胚为材料,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆获得了三个TaLEC2基因,分别命名为TaLEC2-3A、TaLEC2-3B和TaLEC2-3D,它们分别编码248、405和301个氨基酸,含有B3结构域。系统进化树分析发现,TaLEC2s与拟南芥的LEC2在同一分支上。亚细胞定位结果显示,TaLEC2蛋白均定位在细胞核内。qRT-PCR分析结果显示,... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
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1 前言
    1.1 小麦籽粒大小和粒重的研究现状
    1.2 小麦再生和遗传转化的研究现状
    1.3 转录因子LEC1和LEC2的功能
        1.3.1 LEC1和LEC2转录因子对胚胎发育的影响
        1.3.2 LEC1和LEC2转录因子对种子成熟和存储化合物积累的影响
        1.3.3 LEC1和LEC2转录因子对种子大小的影响
    1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料与其生长培养条件
        2.1.2 菌株与质粒载体
        2.1.3 酶及其生化试剂
        2.1.4 主要实验仪器
        2.1.5 引物序列合成
        2.1.6 DNA测序
        2.1.7 实验引物
    2.2 实验方法
        2.2.1 植物组织中总RNA的提取
        2.2.2 反转录合成第一链的cDNA
        2.2.3 植物组织中DNA的提取
        2.2.4 培养基的配置
        2.2.5 克隆构建载体
            2.2.5.1 PCR反应扩增目的片段
            2.2.5.2 目的片段的胶回收
            2.2.5.3 载体的连接与转化
            2.2.5.4 质粒DNA的提取
        2.2.6 表达载体的构建
            2.2.6.1 酶切连接反应
            2.2.6.2 表达载体的连接转化
        2.2.7 根瘤农杆菌的连接转化
        2.2.8 DNA产物纯化
        2.2.9 小麦TaLEC-OX、amiRLEC和TaLEC2-DOWN表达载体的构建
        2.2.10 农杆菌介导的小麦遗传转化实验
        2.2.11 转基因小麦阳性植株的鉴定
            2.2.11.1 bar试纸条鉴定
            2.2.11.2 PCR鉴定
        2.2.12 mRNA原位杂交实验
            2.2.12.1 小麦胚的固定与包埋
            2.2.12.2 制备探针
            2.2.12.3 组织切片
            2.2.12.4 脱蜡和复水
            2.2.12.5 杂交液的配制
            2.2.12.6 杂交后处理
            2.2.12.7 信号检测
        2.2.13 苏丹红染色
        2.2.14 转基因小麦幼胚石蜡切片实验
            2.2.14.1 材料的固定
            2.2.14.2 脱水与浸蜡
            2.2.14.3 复水和染色
        2.2.15 烟草的瞬时转化
3 结果与分析
    3.1 TaLEC2、TaLEC1基因的克隆和进化树分析
    3.2 TaLEC2、TaLEC1蛋白的亚细胞定位
    3.3 TaLEC2、TaLEC1基因的表达模式分析
    3.4 TaLEC基因在小麦中的遗传转化
    3.5 过表达TaLEC2和TaLEC1对体细胞胚和胚性细胞形成的影响
        3.5.1 过表达TaLEC2-3D对Fielder小麦胚性细胞的诱导作用
        3.5.2 TaLEC2-3D-OX对其它小麦种质材料胚性细胞的诱导作用
        3.5.3 TaLEC2-3D-OX诱导体细胞胚发生的组织学观察
        3.5.4 TaLEC2-3D-OX诱导体细胞胚发生的扫描电镜观察
        3.5.5 T2代TaLEC2-3D-OX转基因小麦幼胚外植体上体细胞胚和胚性细胞团的观察
        3.5.6 TaLEC2-3D-OX愈伤组织中胚胎特异基因的表达
        3.5.7 TaLEC2-3D-OX愈伤组织中生长素合成基因的表达
    3.6 TaLEC2小麦转基因植株的表型分析
        3.6.1 T0代TaLEC2小麦转基因植株的基因型鉴定
        3.6.2 T1代TaLEC2小麦转基因植株的表型分析
        3.6.3 T2代TaLEC2小麦转基因植株的表型分析
4 讨论
    4.1 TaLEC2基因调控体细胞胚的再生以及提高遗传转化效率
    4.2 TaLEC2基因调控小麦的籽粒大小和粒重
    4.3 TaLEC1基因促进胚性细胞的产生
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[2]我国部分主推小麦品种组织培养再生能力评价[J]. 张伟,尹米琦,赵佩,王轲,杜丽璞,叶兴国.  作物学报. 2018(02)
[3]小麦规模化转基因技术体系构建及其应用[J]. 叶兴国,徐惠君,杜丽璞,何光源,王轲,林志珊.  中国农业科学. 2014(21)
[4]不同生长素类型及ABA搭配对小麦幼胚再生效果的影响[J]. 别晓敏,杜丽璞,佘茂云,徐惠君,叶兴国.  核农学报. 2011(05)
[5]小麦成熟胚高频植株再生系统的建立[J]. 丁莉萍,何光源.  植物生理学通讯. 2004(02)
[6]小麦胚愈伤组织的诱导和植株再生[J]. 杨淑慎,郭振,徐虹.  西北农业学报. 2002(04)
[7]不同小麦基因型及其不同外植体离体培养研究初探[J]. 覃建兵,何光源.  华中农业大学学报. 2001(06)
[8]提高小麦愈伤组织分化频率的因素[J]. 于晓红,朱祯,付志明,安利佳,李向辉.  植物生理学报. 1999(04)
[9]组织培养途径改良定型小麦品种的研究[J]. 叶兴国,徐惠君,赵乐莲,杜丽璞.  作物学报. 1998(03)
[10]用基因枪法将人工雄性不育基因导入小麦的研究初报[J]. 傅荣昭,曹光诚,马江生,李文彬,孙勇加,陈占宽,易明林,郅玉宝,林作辑.  遗传学报. 1997(04)



本文编号：3187270