pH调控嗜线虫致病杆菌抑菌活性机理的初步研究

发布时间：2017-04-20 21:04

  本文关键词：pH调控嗜线虫致病杆菌抑菌活性机理的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：线虫共生菌次生代谢产物具有抑菌、杀虫、抗病毒、抗癌等多种生物活性,在农业和医药领域有广泛应用价值,已成为一类具有较大开发潜力的生物资源。环境pH作为一种重要的外源信号,对共生菌的生长代谢和抑菌活性有较大的影响。但共生菌如何感应环境pH的变化并作出应答,如何通过复杂的代谢调控网络调控其生长代谢与抑菌物质的产生,这方面的研究还鲜有报道。本研究以前期分离鉴定的一株具有较高抑菌活性的嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila YL001为材料,对不同pH条件下YL001菌株的抑菌活性,主要抑菌物质生物合成相关基因转录和表达的差异以及代谢产物差异进行了研究,以期明确环境pH、CpxRA双组份信号转导途径及抑菌物质产生之间的关系,为共生菌代谢物的调控及隐藏天然产物的挖掘提供线索。初步研究结果如下:1.采用生长速率法、琼脂扩散法及活体组织法测定了初始pH4.5、pH5.5、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.5条件下YL001发酵液,乙酸乙酯提取物,甲醇提取物的抑菌活性。结果表明:随着初始pH的升高,发酵液,乙酸乙酯提取物,甲醇提取物的活性也逐渐升高。pH8.5时,发酵液对水稻瘟疫病、辣椒疫霉病、番茄灰霉病、苹果轮纹病、番茄早疫病、甘蓝黑斑病的抑制率均大于90%,对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达到21.00 mm;对番茄灰霉病的治疗作用为44.81%,低于对照药剂(83.22%),保护作用为89.54%,高于对照药剂(78.69%);乙酸乙酯提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为14.65 mm;对番茄灰霉病的治疗作用为39.94%,低于对照药剂(56.63%),保护作用61.22%,低于对照药剂(72.86%);甲醇提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为16.50 mm;对番茄灰霉病治疗作用为27.55%,低于对照药剂(59.18%);保护作用为62.57%,低于对照药剂(73.17%)。2.采用RT-PCR和qRT-PCR技术对初始pH5.5、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.5发酵条件下YL001主要抑菌物质的生物合成基因以及相关主要转录调节子基因的表达进行分析。RT-PCR分析显示:随着pH的升高,主要抑菌物质生物合成基因xcnA~L、isnA~C、pax A~T、XNC_2713及抗疟原虫活性基因xabB~E的表达量逐渐升高,cpxR、ompR和xcnM、xcnN的表达量逐渐降低;qRT-PCR分析显示:与pH5.5条件下相比,在pH8.5条件下,xcn A、isnA、isnB、isnC、paxA、pax B、paxC、paxT、xnd、nilR、rpoB、LrhA及ackA分别上调了1.46、0.53、2.18、2.71、0.88、3.89、3.68、1.64、8.65、1.16、4.07、2.35和0.64倍;cpxR、ompR、xcn M、xcnN、lrp、rpoE、rpoS、cpxA及cpxP的表达水平分别下调了0.64、0.71、0.4、0.81、0.87、0.98、0.998、0.76和0.92倍。3.采用HPLC和LC-MS方法对不同pH培养条件下YL001菌株的代谢差异、乙酸乙酯提取物和甲醇提取物中主要抑菌活性物质的相对含量进行分析。HPLC、LC-MS分析结果显示:在不同条件下,主要抑菌物质的相对含量存在一定的差异,特别是Nematophin的含量差异明显,在pH8.5时比在pH5.5时高2.04倍。甲醇提取物LC-MS分析表明:XCN1含量在pH8.5时较pH5.5条件下提高了15.37倍。上述结果表明,随着pH升高,YL001代谢物活性升高的原因是抑菌物质生物合成基因表达量的升高、活性物质含量的提高以及活性物质种类的增加。
【关键词】：昆虫病原线虫共生菌 抑菌活性 pH 生物合成基因 代谢差异
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 文献综述12-27
• 1.1 昆虫病原线虫共生菌的生物学特征12-14
• 1.1.1 昆虫病原线虫共生菌生活史12-13
• 1.1.2 菌株特征13
• 1.1.3 形态变异13-14
• 1.1.4 嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001简介14
• 1.2 昆虫病原线虫共生菌的杀菌代谢产物及作用机理14-17
• 1.2.1 共生菌杀菌代谢产物15-17
• 1.2.2 共生菌杀菌代谢产物作用机理17
• 1.3 影响共生菌抑菌物质产生的因素17-18
• 1.3.1 离体培养条件下的影响因素17-18
• 1.3.2 活体培养的影响因素18
• 1.4 昆虫病原线虫共生菌、线虫及相互作用的调控18-20
• 1.5 昆虫病原线虫共生菌隐藏天然产物的挖掘及代谢调控20-22
• 1.6 微生物感应胞内外压力的信号通路CpxRA双组份转导系统22-24
• 1.7 微生物对酸碱压力或环境pH扰动的应答机制24-25
• 1.7.1 胞内pH的自我调控24
• 1.7.2 大分子的保护或修复24
• 1.7.3 其它24-25
• 1.8 昆虫病原线虫共生菌的国内研究现状25
• 1.9 问题的提出25-27
• 第二章 不同初始pH条件下YL001菌株代谢物抑菌活性27-37
• 2.1 试验材料27-29
• 2.1.1 供试菌株27-28
• 2.1.2 培养基28
• 2.1.3 供试植物28
• 2.1.4 主要实验材料及化学试剂28
• 2.1.5 主要仪器设备28-29
• 2.2 研究方法29-30
• 2.2.1 菌株活化29
• 2.2.2 不同初始pH条件下YL001菌株胞外代谢产物的制备29
• 2.2.3 不同初始pH条件下YL001菌株代谢物活性测定29-30
• 2.2.4 数据处理30
• 2.3 结果与分析30-35
• 2.3.1 不同初始pH条件下YL001菌株胞外代谢产物对植物病原真菌的抑制作用 . 1930-31
• 2.3.2 不同初始pH条件下YL001菌株胞外代谢产物对植物病原细菌的抑制作用 . 202.3.3 不同初始pH条件下YL001菌株胞外代谢产物提取物活性测定31-32
• 2.3.3 不同初始 p H 条件下 YL001 菌株胞外代谢产物提取物活性测定32-33
• 2.3.4 不同初始pH条件下YL001菌株胞外代谢产物及提取物对番茄灰霉病的防治33-35
• 2.4 小结35-37
• 第三章 不同初始pH条件下YL001菌株抑菌物质合成相关基因表达分析37-58
• 3.1 试验材料38
• 3.1.1 供试菌株38
• 3.1.2 主要试剂38
• 3.1.3 主要仪器38
• 3.2 研究方法38-45
• 3.2.1 不同初始pH条件下YL001菌株抑菌物质及转录调节子基因表达差异分析38-45
• 3.3 结果与分析45-56
• 3.3.1 RNA提取结果45-46
• 3.3.2 RNA结果验证46
• 3.3.3 内参基因和目的基因扩增循环数验证46-47
• 3.3.4 半定量测定抑菌物质生物合成基因表达差异47-48
• 3.3.5 实时定量测定抑菌物质生物合成及其它相关基因的表达差异48-56
• 3.4 小结56-58
• 第四章 不同初始pH条件下YL001菌株胞外代谢产物差异分析58-63
• 4.1 试验材料59
• 4.1.1 供试菌株59
• 4.1.2 主要试剂59
• 4.1.3 主要仪器59
• 4.2 研究方法59
• 4.2.1 HPLC及LC-MS分析不同初始pH条件下YL001代谢差异59
• 4.3 结果与分析59-62
• 4.3.1 不同初始pH条件下YL001菌株发酵液乙酸乙酯提取物代谢差异分析60-61
• 4.3.2 不同初始pH条件下YL001菌株发酵液甲醇提取物代谢差异分析61-62
• 4.4 小结62-63
• 第五章 讨论63-69
• 5.1 不同初始pH培养条件下YL001抑菌活性差异分析63-65
• 5.1.1 不同初始pH培养条件下YL001抑菌活性的研究方法63
• 5.1.2 不同初始pH培养条件下YL001抑菌活性分析63-65
• 5.2 不同初始pH培养条件下YL001抑菌物质生物合成相关基因基因表达差异分析65-67
• 5.2.1 不同初始pH培养条件下YL001总调节子及转录调节子表达差异分析65-66
• 5.2.2 不同初始pH培养条件下YL001抑菌物质合成基因表达差异分析66
• 5.2.3 不同初始pH培养条件下YL001杀虫活性物质合成基因表达差异分析66-67
• 5.3 不同初始pH培养条件下YL001代谢差异分析67-69
• 第六章 结论69-70
• 参考文献70-77
• 附录77-85
• 致谢85-87
• 作者简介87

【参考文献】

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本文编号：319503