猪转铁蛋白受体与PPV-VP2相互作用的初步研究

发布时间：2017-04-21 08:13

  本文关键词：猪转铁蛋白受体与PPV-VP2相互作用的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：转铁蛋白受体(TfR)是位于细胞膜上的Ⅱ型跨膜糖蛋白,能够介导含铁的转铁蛋白从胞外转移至胞内。猪细小病毒(PPV)的基因组由长度约为5000nt的单股负链DNA构成,可编码三种结构蛋白(VP1,VP2及VP2)及三种非结构蛋白(NS1,NS2及NS3)。VP2占据病毒衣壳的绝大部分,约80%,并且能够自我组装成类病毒粒子。病毒的感染和复制起始于其与细胞表面受体的结合,这也是影响病毒宿主特异性、致病性及组织嗜性的关键因素之一。已有研究证实,与PPV同属的犬细小病毒(CPV)和猫瘟热病毒(FPV)的细胞表面受体是TfR,通过病毒的VP2蛋白与其结合,进而感染细胞。尽管PPV与CPV衣壳蛋白氨基酸的组成不尽相同,但其同源性较高,可达50~60%。基于此同源性可推测PPV也能够通过VP2与细胞表面的TfR结合,进而感染细胞。然而,很少有明确的证据表明,TfR是PPV的细胞表面受体,甚至有些证据表明,TfR不是PPV的细胞表面受体。为了明确TfR是否为PPV的受体,本实验进行前期的准备以及一些初步检测,主要包括定量PCR检测方法的建立、蛋白的表达及相互作用的初步鉴定、稳定表达猪TfR的HEK293细胞系的建立等。本研究针对PPV VP2、Tf R和管家基因β-actin的序列设计了特异性的引物,分别建立了SYBRGreen荧光定量PCR检测方法。结果表明:所构建的荧光定量PCR检测方法均无非特异性扩增,检测下线均在10拷贝以内,变异系数均小于3%。本研究建立的SYBR Green荧光定量PCR方法重复性好、敏感性高、特异性强,适用于对PPV及TfR的定量检测。利用所建立的SYBR Green荧光定量PCR检测方法对PPV感染ST前后PPV的增殖情况及TfR的转录时象进行了对应检测分析,结果表明:PPV在感染ST细胞前后消耗了一定的猪TfR来进行自身的增殖,TfR消耗特征符合作为PPV的细胞表面受体的特征。免疫共沉淀是一种研究蛋白之间相互作用的方法,本研究分别构建了VP2和TfR的重组表达质粒,利用激光共聚焦试验证实了VP2蛋白和TfR蛋白可在细胞膜上共定位,进一步才用免疫共沉淀试验验证二者是否具有相互作用,结果表明:二者不存在直接相互作用或不具有相互作用。为进一步探索二者的相互作用,本研究构建了稳定表达猪TfR的HEK293细胞系并对其进行了鉴定,结果表明,所构建的细胞系TfR基因的整合效率达90%以上,蛋白的表达效率也较高。而PPV对该细胞的感染试验表明PPV对该细胞不具有感染能力。以上试验结果表明TfR不是PPV的细胞表面受体,PPV的细胞表面受体还有待进一步研究。
【关键词】：猪细小病毒 猪转铁蛋白受体 荧光定量PCR 免疫共沉淀 稳定细胞系
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-15
• 英文缩略表15-16
• 第一章 引言16-23
• 1.1 猪细小病毒的研究进展16-19
• 1.1.1 PPV的病原学16-17
• 1.1.2 基因组结构17-18
• 1.1.3 基因组的复制与转录18
• 1.1.4 PPV基因组编码蛋白和功能18-19
• 1.2 转铁蛋白受体的研究进展19-21
• 1.2.1 TfR的结构19-20
• 1.2.2 TfR的功能20-21
• 1.3 病毒的细胞受体21-22
• 1.3.1 细胞表面病毒受体的研究方法21
• 1.3.2 TfR作为病毒细胞受体的研究进展21-22
• 1.4 本研究的目的和意义22-23
• 第二章 荧光定量PCR方法的建立及应用23-34
• 2.1 材料23
• 2.1.1 细胞、毒株及主要试剂23
• 2.1.2 主要仪器设备23
• 2.2 方法23-26
• 2.2.1 引物设计23-24
• 2.2.2 PPV在ST细胞上的增殖实验24
• 2.2.3 病毒DNA的提取24
• 2.2.4 病毒及细胞总RNA的提取及反转录24-25
• 2.2.5 荧光定量PCR标准曲线的建立25
• 2.2.6 敏感性分析25-26
• 2.2.7 特异性分析26
• 2.2.8 重复性分析26
• 2.2.9 PPV增殖曲线的建立26
• 2.2.10 荧光定量PCR方法检测PPV感染ST细胞后PPV增殖情况及TfRmRNA转录水平的变化26
• 2.2.11 统计分析26
• 2.3 结果26-32
• 2.3.1 荧光定量PCR的引物特异性鉴定26-27
• 2.3.2 荧光定量标准曲线的建立27-30
• 2.3.3 敏感性分析结果30
• 2.3.4 特异性分析结果30-31
• 2.3.5 重复性分析结果31
• 2.3.6 PPV的增殖曲线31-32
• 2.3.7 PPV感染后的TfR的转录实相32
• 2.4 讨论32-34
• 第三章 TfR和VP2的真核表达34-45
• 3.1 材料34-35
• 3.1.1 细胞、质粒及主要试剂34
• 3.1.2 主要仪器34-35
• 3.2 方法35-40
• 3.2.1 引物的设计35
• 3.2.2 真核表达质粒的构建35-38
• 3.2.3 HEK293T细胞的复苏38
• 3.2.4 HEK293T细胞的培养38
• 3.2.5 细胞的转染38
• 3.2.6 Western blot检测38-39
• 3.2.7 激光共聚焦实验39
• 3.2.8 免疫共沉淀实验39-40
• 3.3 结果40-44
• 3.3.1 目的基因的扩增结果40
• 3.3.2 重组质粒的鉴定40-41
• 3.3.3 Western blot检测重组质粒的表达41-42
• 3.3.4 用激光共聚焦实验检测VP2蛋白和TfR蛋白的共定位42
• 3.3.5 用免疫共沉淀实验检测VP2蛋白和TfR蛋白的相互作用42-44
• 3.4 讨论44-45
• 第四章 稳定表达猪TfR的HEK293细胞系的建立45-57
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 细胞、质粒和菌种45
• 4.1.2 主要试剂45
• 4.1.3 主要实验仪器45-46
• 4.2 方法46-51
• 4.2.1 引物的设计46
• 4.2.2 pLVX-TfR-His重组质粒的构建与鉴定46-48
• 4.2.3 TfR在HEK293T细胞中的瞬时表达及western blot鉴定48
• 4.2.4 重组慢病毒包装及病毒滴度的测定48-49
• 4.2.5 慢病毒转导和细胞筛选49-50
• 4.2.6 筛选细胞的鉴定50
• 4.2.7 病毒感染实验50-51
• 4.3 结果51-56
• 4.3.1 重组慢病毒载体的构建51
• 4.3.2 HEK293T细胞的绿色荧光检测及western blot鉴定51-52
• 4.3.3 重组慢病毒包装及病毒滴度的测定52
• 4.3.4 HEK293-TfR细胞及HEK293-ZsGreen细胞的筛选52-53
• 4.3.5 筛选细胞的鉴定53-54
• 4.3.6 病毒感染试验54-56
• 4.4 讨论56-57
• 第五章 全文结论57-58
• 参考文献58-65
• 致谢65-66
• 作者简历66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 李昌文,仇华吉,童光志;猪细小病毒研究进展[J];动物医学进展;2004年01期

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  本文关键词：猪转铁蛋白受体与PPV-VP2相互作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：319921