牛FABP3转基因小鼠的遗传检测及功能验证

发布时间：2017-04-21 17:17

  本文关键词：牛FABP3转基因小鼠的遗传检测及功能验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：FABP3基因是影响牛肌内脂肪沉积的重要基因,与大理石花纹、背膘厚、剪切力等指标具有较高的相关性,因此,将该基因转入小鼠体内,研究牛FABP3基因在小鼠体内遗传和表达特性,明确该基因功能,对培育优质高产转基因肉牛新品种具有重要意义。本研究主要将牛FABP3基因转入小鼠体内,并检测了目的基因FABP3在转基因小鼠及其子代小鼠体内的遗传情况;同时,利用荧光定量和组织原位杂交技术验证小鼠不同组织中牛FABP3基因表达水平,以及转基因小鼠在营养调控下的脂肪代谢相关血液生化指标差异,以期探明转牛FABP3基因小鼠的遗传与表达水平,为牛FABP3基因功能研究奠定基础,也为牛的分子遗传育种提供理论依据。本研究取得结果如下:(1)通过活体荧光鉴定和RT-PCR检测,结果表明前期获得4只G0转基因小鼠(2雌2雄)为阳性转基因个体,可以用于后续的遗传检测和基因功能研究。(2)对4只G0代阳性个体制定4组交配方案并获得G1代子鼠,对G1子鼠进行PCR扩增检测和测序及Blast比对,结果表明阳性个体扩增片段均包含EGFP报告基因和牛FABP3目的基因;G1代子鼠平均阳性率为67.8%,且不同组间阳性率存在差异,其中组1阳性率最高为100%。(3)对G1代转基因阳性率为100%的组1内个体进行随机交配并传代至G4代,通过PCR扩增检测和测序及Blast比对发现,G2代子鼠平均阳性率为100%,G3代为33.3%,G4代为18.75明,G0代转基因阳性小鼠可将目的基因遗传给后代,但随着代次的增加,目的基因在后代个体中比例呈下降。(4)利用实时荧光定量PCR技术,在mRNA水平对牛FABP3基因在G0代和G1代小鼠心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌组织的表达情况进行了检测和表达量分析。结果表明转基因小鼠心肌和骨骼肌中总FABP3表达量显著高于非转基因个体(P0.05)。(5)利用Western Blot、对G0、G1、G2、G3代阳性转基因小鼠心肌和骨骼肌中FABP3蛋白以及GFP蛋白的表达情况进行了检测,结果表明阳性转基因小鼠中FABP3基因的表达量相对野生型个体有所增加,GFP蛋白可以在小鼠的心脏和骨骼肌中得到表达。(6)对G1代转基因小鼠进行饲养试验,即在高油营养水平对牛FABP3基因功能的验证。结果表明高油日粮组转基因小鼠和非转基因小鼠体重差异不显著(P0.05),普通日粮组转基因小鼠与非转基因小鼠体重差异不显著(P0.05),转基因高油日粮小鼠与非转基因日粮小鼠差异显著(P0.05)。通过血液生化指标检测,转基因高油日粮小鼠胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、肌酐等含量均略高于野生型普通日粮个体。(7)对转基因小鼠G0、G1代个体进行了组织原位表达检测,在G0代个体中表达量较高,G1代个体中能看到绿色荧光,但略有降低。结果也表明GFP蛋白可以在小鼠体内表达,并能够在遗传中传递给下一代。这与蛋白质免疫印迹中GFP检测结果相一致。(8)通过基因捕获技术,分析外源基因在小鼠基因组中的整合位点,结果检测到2只转基因小鼠的外源基因插入位点分别位于9号和12号染色体上,且存在重复序列。
【关键词】：转基因小鼠 FABP3基因 肌内脂肪 遗传检测 牛
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823;Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 文献综述13-19
• 1.1 引言13
• 1.2 转基因小鼠研究进展13-14
• 1.3 转基因动物存在问题14-15
• 1.4 FABP3研究进展15-16
• 1.4.1 FABP3基因的生物学功能15
• 1.4.2 FABP3在家畜育种中的研究15-16
• 1.5 营养调控与基因调控的互作16-17
• 1.6 研究的目的和意义17-18
• 1.7 技术路线18-19
• 第二章 FABP3转基因小鼠各世代DNA水平阳性鉴定19-27
• 2.1 试验材料19-20
• 2.1.1 试验动物及设计19
• 2.1.2 主要试剂19-20
• 2.1.3 试验仪器设备20
• 2.2 试验方法20-21
• 2.2.1 小鼠尾组织基因组DNA提取20-21
• 2.2.2 PCR引物合成及片段扩增21
• 2.3 结果21-26
• 2.3.1 G0代转基因小鼠阳性检测21-22
• 2.3.2 G1代转基因小鼠阳性检测22-24
• 2.3.3 测序结果24-25
• 2.3.4 后代测定25-26
• 2.4 讨论26
• 2.5 小结26-27
• 第三章 转基因小鼠FABP3 RNA和蛋白水平表达27-35
• 3.1 试验材料27-28
• 3.1.1 试验动物27
• 3.1.2 试验试剂27
• 3.1.3 试剂配置27-28
• 3.1.4 试验仪器设备28
• 3.2 试验方法28-30
• 3.2.1 总RNA提取及荧光定量操作28-30
• 3.2.2 蛋白提取及Western Blot操作步骤30
• 3.3 结果30-33
• 3.3.1 转基因子代小鼠mRNA表达差异30-32
• 3.3.2 Western Blot检测转基因小鼠蛋白重组表达32-33
• 3.4 讨论33-34
• 3.5 小结34-35
• 第四章 转基因小鼠脂肪代谢生化指标及原位表达检测35-41
• 4.1 试验材料35-36
• 4.1.1 试验动物及饲养35-36
• 4.1.2 试验试剂及材料36
• 4.1.3 试验仪器设备36
• 4.2 试验方法36-37
• 4.2.1 体重及血液指标检测36-37
• 4.2.2 切片制做37
• 4.3 结果37-39
• 4.3.1 转基因小鼠饲养结果37-38
• 4.3.2 组织切片结果38-39
• 4.4 讨论39-40
• 4.5 小结40-41
• 第五章 牛FABP3在转基因小鼠上的插入位点41-44
• 5.1 试验材料41-42
• 5.1.1 基因捕获原理41
• 5.1.2 材料和方法41-42
• 5.2 结果42
• 5.3 讨论42-43
• 5.4 小结43-44
• 第六章 结论44-45
• 6.1 主要结论44
• 6.2 下一步工作44-45
• 参考文献45-52
• 致谢52-53
• 作者简历53

【参考文献】

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