鳗弧菌MHK3株T6SS的功能性表达及抗菌特性

发布时间：2017-04-22 20:13

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【摘要】：鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是重要的海水养殖动物病原菌,广泛生存于各种不同的海洋环境中。海洋细菌具有多种适应海洋环境的策略,而鳗弧菌适应海洋生态环境的机制研究不多。细菌的Ⅵ型分泌系统(T6SS)是一种新的蛋白分泌系统,在许多海洋细菌的致病性和环境适应性方面发挥重要作用。本文开展了鳗弧菌MHK3株T6SS的表达及其介导的抑菌作用的研究,旨在深入了解鳗弧菌的生态适应机制。主要的研究内容和结果如下：1.不同培养条件对鳗弧菌MHK3 T6SS表达和分泌功能的影响。Hcp(溶血素共调蛋白)是依赖T6SS分泌的一个基质蛋白,有T6SS的细菌能够将Hcp分泌到细菌外是T6SS具有功能的一个重要特征。在实验室适宜培养条件下,鳗弧菌MHK3的T6SS具有分泌Hcp的功能。本研究利用qRT-PCR和Western bolt方法,分析MHK3在各种温度(10℃、16℃、28℃、37℃)、盐度(0.2%、0.5%、1.0%、3.0%、5.0%NaCl)和pH(6、7、8、9、10)条件下表达和分泌Hcp的特征。结果显示,Hcp在10-37℃培养时均可表达和分泌,在转录水平上,Hcp mRNA表达量随温度升高而降低,在10℃的表达量最高：在蛋白水平上,胞内Hcp蛋白量在10-37℃变化不大,而胞外Hcp蛋白量在10-28℃较高,在37℃较低。Hcp在0.2-5%NaCl均有表达和分泌,在转录水平上,Hcp mRNA表达量在3% NaCl条件下最高,在其它盐度条件下的表达量均较低；在蛋白水平上,胞内和胞外Hcp蛋白量在0.5-5%NaCl均较高,在0.2%NaCl条件下较低。Hcp在pH 6-10均有表达,在转录水平上,Hcp mRNA表达量在pH8时最高；在蛋白水平上,胞内和胞外的Hcp蛋白量随pH提高而减少,在pH 10时MHK3不分泌Hcp。蛋白稳定性实验结果显示,分泌到胞外的Hcp蛋白8h内保持稳定而不降解。上述结果表明,在海洋环境的物理因子变化较剧烈的条件下,鳗弧菌依然能够表达和分泌Hcp,发挥T6SS的分泌功能。2.密度感应系统调节基因luxO对MHK3 T6SS表达和分泌的影响。构建了MHK3 luxO基因的缺失突变株(ΔluxO),研究发现在实验室培养条件下ΔluxO的生长速率变慢。通过qRT-PCR和Western blot比较分析MHK3野生株及突变株ΔluxO、AvasC (MHK3 T6SS结构基因vasC的缺失株)在不同生长时期(OD540nm=0.1、0.6、1.0、2.0)Hcp的表达和分泌。结果显示,与野生株MHK3相比,在整个生长期ΔluxO和ΔvasC的Hcp mRNA转录水平很低,AluxO的胞内和胞外没有检测到Hcp蛋白,而仅在AvasC胞内能检测到Hcp蛋白。这些结果说明,luxO基因在转录水平上影响hcp基因的表达；vasC基因的缺失导致T6SS结构不完整,影响Hcp分泌到细胞外。3.鳗弧菌MHK3 T6SS介导的抑菌作用。分别建立野生株MHK3 (T6SS具有分泌Hcp的功能,Hcp+)及其突变株ΔluxO(T6SS没有分泌Hcp的功能,Hcp-)、AvasC (Hcp)与大肠杆菌(Escherichia coli)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的共培养体系,相互作用4h后进行细菌计数。结果显示,在MHK3 (Hcp+)与E. coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的共培养体系,MHK3 (Hcp+)的数量没有明显变化,而E.coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的细菌数量下降2-3 logs；在ΔluxO(Hcp-)或AvasC (Hcp-)与E. coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的共培养体系,所有的细菌数量没有明显变化。上述结果表明,T6SS介导鳗弧菌MHK3抑制E. coli和E.tarda的生长。
【关键词】：鳗弧菌 T6SS Hcp luxO 抑菌
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 1 文献综述13-24
• 1.1 弧菌概述13
• 1.2 鳗弧菌概述13-17
• 1.2.1 分类学地位及生物学特征13-14
• 1.2.2 鳗弧菌病14
• 1.2.3 鳗弧菌致病因子14-16
• 1.2.3.1 铁螫合系统14-15
• 1.2.3.2 胞外产物15
• 1.2.3.3 趋化作用和运动性15
• 1.2.3.4 LPS15
• 1.2.3.5 胞外多糖15-16
• 1.2.3.6 外膜蛋白16
• 1.2.3.7 密度感应系统16
• 1.2.4 鳗弧菌病的防治16-17
• 1.3 T6SS系统17-21
• 1.3.1 T6SS的结构17-19
• 1.3.1.1 Hcp17
• 1.3.1.2 VgrG17-18
• 1.3.1.3 TssB/TssC(VipA/VipB)18
• 1.3.1.4 TssE18
• 1.3.1.5 TagL/TssL、TssJ、TssM18-19
• 1.3.2 T6SS的功能19-20
• 1.3.2.1 增强对宿主的致病性19
• 1.3.2.2 减少宿主的致病性19-20
• 1.3.2.3 介导与其他细菌的相互作用20
• 1.3.2.4 提高对环境的适应性20
• 1.3.3 T6SS研究进展20-21
• 1.4 密度感应系统21-22
• 1.4.1 弧菌的密度感应系统21
• 1.4.2 AHL信号分子21
• 1.4.3 鳗弧菌的密度感应系统21-22
• 1.5 本论文研究的目的和意义22-24
• 2 环境因子对鳗弧菌MHK3T6SS表达和分泌的影响24-38
• 引言24
• 2.1 材料和方法24-31
• 2.1.1 菌株、培养基、抗体、引物24-25
• 2.1.2 不同培养条件细菌培养物的制备25-26
• 2.1.3 qRT-PCR检测26-28
• 2.1.3.1 细菌总RNA的提取26
• 2.1.3.2 消化样品中的DNA26-27
• 2.1.3.3 RNA反转录27
• 2.1.3.4 qRT-PCR检测Hcp的表达27-28
• 2.1.4 Western blot检测Hcp的表达和分泌28-29
• 2.1.4.1 胞外和胞内蛋白组分的制备和提取28-29
• 2.1.4.2 Western blot分析蛋白分泌和表达29
• 2.1.5 Hcp的稳定性检测29-30
• 2.1.6 数据分析30-31
• 2.2 实验结果31-36
• 2.2.1 不同培养温度对鳗弧菌Hcp表达和分泌的影响31-32
• 2.2.2 不同盐度对Hcp表达和分泌的影响32-33
• 2.2.3 不同pH对MHK3 Hcp表达和分泌的影响33-35
• 2.2.4 Hcp的稳定性35-36
• 2.3 讨论36-38
• 3 密度感应系统调节因子luxO对鳗弧菌MHK3 T6SS表达和分泌的影响38-51
• 引言38
• 3.1 材料和方法38-44
• 3.1.1 菌株和质粒38-40
• 3.1.2 luxO突变菌株的构建40-43
• 3.1.2.1 原理40
• 3.1.2.2 引物设计40-41
• 3.1.2.3 luxO基因缺失片段的构建41
• 3.1.2.4 重组自杀质粒的构建41-42
• 3.1.2.5 接合42-43
• 3.1.2.6 二次同源重组和突变株的筛选43
• 3.1.3 突变株及其野生株的生长曲线测定43-44
• 3.1.3.1 在TSB培养条件下各菌株的生长曲线测定43
• 3.1.3.2 在2216E海水培养条件下各菌株的生长曲线测定43-44
• 3.1.4 突变菌及野生株Hcp在不同生长期分泌表达的分析44
• 3.1.4.1 qRT-PCR分析Hcp mRNA表达44
• 3.1.4.2 Western blot分析Hcp的表达和分泌44
• 3.1.5 数据分析44
• 3.2 实验结果44-49
• 3.2.1 luxO突变菌株的鉴定44-45
• 3.2.2 突变株及其野生株的生长曲线测定45-47
• 3.2.3 突变菌及野生株Hcp在不同生长期的表达和分泌47-49
• 3.2.3.1 qRT-PCR分析Hcp的表达47-48
• 3.2.3.2 Western blot分析Hcp的表达和分泌48-49
• 3.3 讨论49-51
• 4 T6SS介导的鳗弧菌MHK3的抑菌作用51-61
• 引言51
• 4.1 材料和方法51-55
• 4.1.1 实验菌株、培养基51-52
• 4.1.2 从海水环境中分离E.coli及利福平抗性菌株的筛选52-53
• 4.1.3 鳗弧菌与E.tarda的共培养体系及细菌计数53-54
• 4.1.4 鳗弧菌与E.coli的共培养体系及细菌计数54-55
• 4.2 结果55-58
• 4.2.1 环境中E.coli的分离及利福平抗性菌株的筛选55
• 4.2.2 鳗弧菌对E. tarda的抑制效果55-57
• 4.2.3 鳗弧菌对E. coli的抑制效果57-58
• 4.3 讨论58-60
• 4.4 总结和展望60-61
• 参考文献61-72
• 附录72-75
• 致谢75-76
• 个人简历76

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