大黄鱼神经肽Y的高活性表达及活性功能特征研究
发布时间：2021-07-09 19:08
大黄鱼（Larimichthys crocea）作为我国重要的海洋经济物种之一,由于常年过度的捕捞,天然资源遭受严重破坏,其渔业资源亟待补充。因此,研究大黄鱼生长相关的调控机制具有重要的实际意义。本论文主要基于哺乳动物细胞表达系统开发了大黄鱼神经肽Y（Neuropeptide Y;NPY）高活性表达技术,并对表达产物的活性进行了评测;同时以实验室成功构建的FLAG-LcNPY2R/7R（FLAG-Larimichthys crocea Neuropeptide Y2/Y7 Receptor）,LcNPY2R/7R-EGFP（Larimichthys crocea Neuropeptide Y2/Y7 Receptor-EGFP）融合表达载体为基础,对合成和分泌制备的多肽LcNPY激活LcNPY2R/7R后介导的信号转导机制进行了系统研究。通过在pcDNA3.1（+）真核表达载体中插入LcNPY成熟肽、LcNPY 18-36截断体多肽、六聚组氨酸连接成熟肽和六聚组氨酸连接18-36截断体多肽这四种重组插入片段,成功构建出能够表达大黄鱼NPY的真核表达系统。将固相合成的LcNPY作为对照,...
【文章来源】：浙江海洋大学浙江省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NPY在中枢神经系统中的调节作用[25]
大黄鱼神经肽Y的高活性表达及活性功能特征研究6图1.2内源性和外源性（静脉）PVAX/NPY3-36相关血管生成机制[68]。Fig1.2Summaryofproposedmechanismforendogenousandexogenous(intravenous)PVAX/NPY3-36-associatedangiogenesis.1.3.3NPY对神经内分泌的调节NPY分布于下丘脑弓状核、室旁核、室周核、正中隆起等多个区域，这些区域又是许多内分泌细胞存在的部位，它们相互联系共同调节机体复杂的生理活动。已有的研究证明，NPY对生长激素（GH）、促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasinghormone，GnRH）、催乳素（prolactin，PRL）、促甲状腺激素（thyroidstimulatinghormone，TSH）、生长抑素（Somatostatin，SS）、黄体生成素（luteinizinghormone，LH）、促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasinghormone，CRH）和促性腺激素（GtH）等内分泌激素都有一定的调节作用[48,69,70]。1.3.3.1NPY对下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic–pituitary–gonadalaxis，HPG轴）调节的影响研究表明下丘脑-垂体-性腺轴释放的激素分别为：GnRH、LH/卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，FSH）和性激素。GnRH/GnRHR信号系统是生殖发育HPG调控轴的关键组成。早在1988年，在研究NPY、GnRH在兔子以及小鼠中表
152.1.2.4LcNPY氨基酸同源性和系统发育分析使用Bioedit程序对多物种NPY成熟肽氨基酸序列进行多序列比对和同源性分析；利用MEGA5.2软件，通过邻接法(NJ法)构建NPY基因分子进化系统树(Bootstrap重复1000次计算各分支置信度)。2.2结果2.2.1LcNPY的哺乳动物真核表达系统构建基于已有数据库得到优化后的密码子（表2.3）。采用限制性核酸内切酶HindIII和BamHI对pcDNA3.1-NPY质粒进行双酶切鉴定（图2.1）。根据目的条带的位置，初步断定正确性，继而通过测序结果确认序列与LcNPY的序列完全一致，证明pcDNA3.1-NPY融合蛋白表达载体构建成功。使用snapgene软件绘制pcDNA3.1-NPY1-36真核表达载体结构图（图2.2）。图2.1pcDNA3.1-NPY质粒双酶切鉴定图Fig2.1ElectrophoretogramofdigestionbyrestrictionenzymesHindIIIandBamHI图2.2pcDNA3.1-NPY1-36真核表达载体结构图Fig2.2ThestructureofeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1-NPY1-36大黄鱼神经肽Y的高活性表达及活性功能特征研究
本文编号：3274323
【文章来源】：浙江海洋大学浙江省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NPY在中枢神经系统中的调节作用[25]
大黄鱼神经肽Y的高活性表达及活性功能特征研究6图1.2内源性和外源性（静脉）PVAX/NPY3-36相关血管生成机制[68]。Fig1.2Summaryofproposedmechanismforendogenousandexogenous(intravenous)PVAX/NPY3-36-associatedangiogenesis.1.3.3NPY对神经内分泌的调节NPY分布于下丘脑弓状核、室旁核、室周核、正中隆起等多个区域，这些区域又是许多内分泌细胞存在的部位，它们相互联系共同调节机体复杂的生理活动。已有的研究证明，NPY对生长激素（GH）、促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasinghormone，GnRH）、催乳素（prolactin，PRL）、促甲状腺激素（thyroidstimulatinghormone，TSH）、生长抑素（Somatostatin，SS）、黄体生成素（luteinizinghormone，LH）、促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasinghormone，CRH）和促性腺激素（GtH）等内分泌激素都有一定的调节作用[48,69,70]。1.3.3.1NPY对下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic–pituitary–gonadalaxis，HPG轴）调节的影响研究表明下丘脑-垂体-性腺轴释放的激素分别为：GnRH、LH/卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，FSH）和性激素。GnRH/GnRHR信号系统是生殖发育HPG调控轴的关键组成。早在1988年，在研究NPY、GnRH在兔子以及小鼠中表
152.1.2.4LcNPY氨基酸同源性和系统发育分析使用Bioedit程序对多物种NPY成熟肽氨基酸序列进行多序列比对和同源性分析；利用MEGA5.2软件，通过邻接法(NJ法)构建NPY基因分子进化系统树(Bootstrap重复1000次计算各分支置信度)。2.2结果2.2.1LcNPY的哺乳动物真核表达系统构建基于已有数据库得到优化后的密码子（表2.3）。采用限制性核酸内切酶HindIII和BamHI对pcDNA3.1-NPY质粒进行双酶切鉴定（图2.1）。根据目的条带的位置，初步断定正确性，继而通过测序结果确认序列与LcNPY的序列完全一致，证明pcDNA3.1-NPY融合蛋白表达载体构建成功。使用snapgene软件绘制pcDNA3.1-NPY1-36真核表达载体结构图（图2.2）。图2.1pcDNA3.1-NPY质粒双酶切鉴定图Fig2.1ElectrophoretogramofdigestionbyrestrictionenzymesHindIIIandBamHI图2.2pcDNA3.1-NPY1-36真核表达载体结构图Fig2.2ThestructureofeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1-NPY1-36大黄鱼神经肽Y的高活性表达及活性功能特征研究
本文编号：3274323
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