华支睾吸虫核酸检测方法的建立与初步应用
发布时间：2021-07-10 05:54
华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）病又称肝吸虫病,全球约3500万人感染,其中中国有超过1200万人感染。人或其他哺乳动物由于食用生或半生被囊蚴感染的鱼虾而感染此病。华支睾吸虫囊蚴经过一个月便可以在宿主体内发育为成虫,成虫寄生于人体胆管及胆囊中,可引起肝脏受损,进而导致肝胆疾病及混合细菌感染等。儿童和青少年感染华支睾吸虫后,临床表现较重,除肝胆症状外,常伴有营养不良、贫血、低蛋白血症、浮肿和发育障碍,是一种危害严重的人兽共患寄生虫病。现阶段对于华支睾吸虫的检测,目前所使用的加藤厚涂片法存在漏检,误检等缺陷。实验室常用的分子生物学检测的方法有传统PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等,免疫学检测方法普遍为ELISA。但这些传统的分子生物学及免疫学检测方法成本较高、操作繁琐、耗费时间较长,进而无法满足基层实地快速化检测。因此,开发低成本、操作简便、检测时间短的华支睾吸虫检测方法,可以大大提高华支睾吸虫检测效率,并为华支睾吸虫的防控提供新的方法和技术支持。本研究针对华支睾吸虫ITS-2基因序列的6个区域设计4条引物,并对该体系的灵敏度、特异性等进行验证后初步建立了华支睾吸虫环...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
华支睾吸虫的生活史Fig.1.1LifehistoryofClonorchissinensis
第一篇文献综述第三章LAMP及RPA检测方法的概述与应用15序列从而进行扩增[78]，原理如图1.2。图1.2LAMP扩增反应原理Fig.1.2LAMPamplificationreactionprinciple3.2RPA检测方法及原理RPA又称重组酶聚合酶扩增技术（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA），是2006年英国TwistDx公司开发出的一种新型等温扩增技术，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物[79]。并且RPA不需要复杂的样品处理，更适用于无法提取核酸的实地检测，该方法将彻底改变在资源有限的环境下扩增和检测核酸的能力，在病原快速化检测方面，具有广阔的应用前景[80]。RPA主要依赖于与单链核酸（即寡核苷酸引物）结合的三种酶，这三种酶分别是单链DNA结合蛋白（Single-strandedDNA-bindingprotein，SSB）和链置换DNA聚合酶及重组酶，三种酶多以冻干粉形式保存[81]。重组酶可以结合引物，形成酶联引物复合物，该复合物与相应的DNA链快速互补配对。发生链替换后，复合物进入5’端形成D环结构；此时，SSB与其结合，然后DNA聚合酶识别重组酶后并将其降解。暴露引物的3’端后，聚合酶借此机会结合到复合物的3’端以进
第一篇文献综述第三章LAMP及RPA检测方法的概述与应用16行链延伸并形成新的双链DNA。整个过程不涉及复杂的温度变化过程，整个过程的温度恒定在37—42℃之间，在15-30min内完成DNA模板的扩增。RPA可以扩增DNA片段，同时也可以扩增RNA片段[82]。AhmedAbdEIWahed建立了逆转录重组酶聚合酶扩增技术（RT-RPA）用于检测冠状病毒，该技术与实时荧光定量PCR具有同样的灵敏度及特异性[83]。RPA设计引物与普通PCR类似，但是也有区别，虽然设计方法类似，但是普通PCR引物却不适于RPA扩增，RPA引物设计要注意引物和扩增子的长度、引物序列及引物对同源序列的选择性。普通PCR引物长度大约为25bp不等，RPA引物长度大于30bp，一般为30-35bp，因为这是重组酶介导引物与同源双链匹配的最小长度，扩增片段的长度设计在100-300bp为最佳。但最近的RPA试剂盒支持扩增长度大于500bp，但是这会导致灵敏度和反应时间延长[84]。在设计引物时，应避免5’端过多的鸟嘌呤，在3’端设计一个GC夹，GC含量应该控制在30-70%，这可以避免引物自身的发夹结构及引物之间形成二聚体，由于各种因素的限制，仅凭理论无法设计出最佳引物，所以我们需要设计多组引物进行筛选[85]。RPA反应原理如图1.3。图1.3RPA扩增反应原理Fig.1.3RPAamplificationreactionprinciple
【参考文献】：
期刊论文
[1]Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立与应用[J]. 朱小甫,吴旭锦,高睿,尚红梅. 中国动物传染病学报. 2019(03)
[2]非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测方法的建立[J]. 哈登楚日亚,樊晓旭,赵永刚,王淑娟,张志诚,戈胜强,李林,吴晓东,王志亮. 中国畜牧兽医. 2017(11)
[3]非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立[J]. 李林,刘拂晓,樊晓旭,李金明,邹艳丽,刘珊,包静月,吴晓东,王志亮. 中国动物检疫. 2017(08)
[4]重组酶聚合酶扩增技术:一种新的核酸扩增策略[J]. 高威芳,朱鹏,黄海龙. 中国生物化学与分子生物学报. 2016(06)
[5]多重PCR技术在植物生物学研究中的应用进展[J]. 任素贤,艾鹏飞,宋层孝,陈文静,宋建军. 安徽农业科学. 2015(06)
[6]基于核糖体DNA ITS区和COX1基因鉴别华支睾吸虫囊蚴[J]. 杨庆利,申继清,蒋智华,杨益超,李红梅,陈颖丹,周晓农. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2014(03)
[7]华支睾吸虫病免疫学诊断方法的研究进展[J]. 徐鹏,刘孝刚,付平. 辽宁医学院学报. 2009(05)
[8]华支睾吸虫生活史在实验室的建立[J]. 梁炽,胡旭初,吕志跃,吴忠道,余新炳,徐劲,郑焕钦. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2009(02)
[9]我国华支睾吸虫病流行区感染现状调查[J]. 方悦怡,陈颖丹,黎学铭,吴军,张启明,阮彩文. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2008(02)
[10]PCR和实时荧光PCR方法检测华支睾吸虫[J]. 张媛,童睿,郑秋月,谢明杰,曹际娟. 寄生虫病与感染性疾病. 2008(01)
硕士论文
[1]鸡肉中主要致病菌多重定量PCR检测[D]. 李慧芳.河北工程大学 2019
[2]家畜日本血吸虫病巢式PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 张欣.中国农业科学院 2017
[3]鹿感染人五毛滴虫巢式PCR检测方法的建立与应用[D]. 董兵.吉林大学 2015
本文编号：3275323
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
华支睾吸虫的生活史Fig.1.1LifehistoryofClonorchissinensis
第一篇文献综述第三章LAMP及RPA检测方法的概述与应用15序列从而进行扩增[78]，原理如图1.2。图1.2LAMP扩增反应原理Fig.1.2LAMPamplificationreactionprinciple3.2RPA检测方法及原理RPA又称重组酶聚合酶扩增技术（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA），是2006年英国TwistDx公司开发出的一种新型等温扩增技术，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物[79]。并且RPA不需要复杂的样品处理，更适用于无法提取核酸的实地检测，该方法将彻底改变在资源有限的环境下扩增和检测核酸的能力，在病原快速化检测方面，具有广阔的应用前景[80]。RPA主要依赖于与单链核酸（即寡核苷酸引物）结合的三种酶，这三种酶分别是单链DNA结合蛋白（Single-strandedDNA-bindingprotein，SSB）和链置换DNA聚合酶及重组酶，三种酶多以冻干粉形式保存[81]。重组酶可以结合引物，形成酶联引物复合物，该复合物与相应的DNA链快速互补配对。发生链替换后，复合物进入5’端形成D环结构；此时，SSB与其结合，然后DNA聚合酶识别重组酶后并将其降解。暴露引物的3’端后，聚合酶借此机会结合到复合物的3’端以进
第一篇文献综述第三章LAMP及RPA检测方法的概述与应用16行链延伸并形成新的双链DNA。整个过程不涉及复杂的温度变化过程，整个过程的温度恒定在37—42℃之间，在15-30min内完成DNA模板的扩增。RPA可以扩增DNA片段，同时也可以扩增RNA片段[82]。AhmedAbdEIWahed建立了逆转录重组酶聚合酶扩增技术（RT-RPA）用于检测冠状病毒，该技术与实时荧光定量PCR具有同样的灵敏度及特异性[83]。RPA设计引物与普通PCR类似，但是也有区别，虽然设计方法类似，但是普通PCR引物却不适于RPA扩增，RPA引物设计要注意引物和扩增子的长度、引物序列及引物对同源序列的选择性。普通PCR引物长度大约为25bp不等，RPA引物长度大于30bp，一般为30-35bp，因为这是重组酶介导引物与同源双链匹配的最小长度，扩增片段的长度设计在100-300bp为最佳。但最近的RPA试剂盒支持扩增长度大于500bp，但是这会导致灵敏度和反应时间延长[84]。在设计引物时，应避免5’端过多的鸟嘌呤，在3’端设计一个GC夹，GC含量应该控制在30-70%，这可以避免引物自身的发夹结构及引物之间形成二聚体，由于各种因素的限制，仅凭理论无法设计出最佳引物，所以我们需要设计多组引物进行筛选[85]。RPA反应原理如图1.3。图1.3RPA扩增反应原理Fig.1.3RPAamplificationreactionprinciple
【参考文献】：
期刊论文
[1]Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立与应用[J]. 朱小甫,吴旭锦,高睿,尚红梅. 中国动物传染病学报. 2019(03)
[2]非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测方法的建立[J]. 哈登楚日亚,樊晓旭,赵永刚,王淑娟,张志诚,戈胜强,李林,吴晓东,王志亮. 中国畜牧兽医. 2017(11)
[3]非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立[J]. 李林,刘拂晓,樊晓旭,李金明,邹艳丽,刘珊,包静月,吴晓东,王志亮. 中国动物检疫. 2017(08)
[4]重组酶聚合酶扩增技术:一种新的核酸扩增策略[J]. 高威芳,朱鹏,黄海龙. 中国生物化学与分子生物学报. 2016(06)
[5]多重PCR技术在植物生物学研究中的应用进展[J]. 任素贤,艾鹏飞,宋层孝,陈文静,宋建军. 安徽农业科学. 2015(06)
[6]基于核糖体DNA ITS区和COX1基因鉴别华支睾吸虫囊蚴[J]. 杨庆利,申继清,蒋智华,杨益超,李红梅,陈颖丹,周晓农. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2014(03)
[7]华支睾吸虫病免疫学诊断方法的研究进展[J]. 徐鹏,刘孝刚,付平. 辽宁医学院学报. 2009(05)
[8]华支睾吸虫生活史在实验室的建立[J]. 梁炽,胡旭初,吕志跃,吴忠道,余新炳,徐劲,郑焕钦. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2009(02)
[9]我国华支睾吸虫病流行区感染现状调查[J]. 方悦怡,陈颖丹,黎学铭,吴军,张启明,阮彩文. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2008(02)
[10]PCR和实时荧光PCR方法检测华支睾吸虫[J]. 张媛,童睿,郑秋月,谢明杰,曹际娟. 寄生虫病与感染性疾病. 2008(01)
硕士论文
[1]鸡肉中主要致病菌多重定量PCR检测[D]. 李慧芳.河北工程大学 2019
[2]家畜日本血吸虫病巢式PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 张欣.中国农业科学院 2017
[3]鹿感染人五毛滴虫巢式PCR检测方法的建立与应用[D]. 董兵.吉林大学 2015
本文编号：3275323
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