大丽轮枝菌U6启动子及棉帚霉菌rDNA序列的分析
发布时间：2021-07-27 21:45
黄萎病是棉花主要病害之一,常常导致棉花生产的经济损失。在我国,棉花黄萎病主要是由病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的。随着基因编辑技术的发展,CRISPR/Cas 9系统已应用于真菌基因功能研究,其中U6启动子是驱动sgRNA转录的重要元件之一,但在大丽轮枝菌中U6启动子序列长度还不清楚。本研究旨在分析大丽轮枝菌内源性U6启动子的长度,为CRISPR/Cas 9系统应用于大丽轮枝菌中提供依据。棉帚霉菌（Scopulariopsis gossypii）是帚霉属中迄今发现的唯一能侵染植物的特例。原先研究发现,用通用引物不能从该种中扩增ITS区,影响了分类研究。本研究利用三代测序获得的rDNA序列,分析和揭示了通用引物不能扩增的原因,并评价了 ITS区在帚霉属中对分类的作用。1.大丽轮枝菌U6启动子的研究为分析U6启动子的长度,利用一步连接法构建四个不同长度U6启动子敲除载体,采用PEG介导法对载体进行原生质体的转化。通过抗性筛选和PCR鉴定,获得不同长度U6启动子的突变体。为了明确不同长度的U6启动子对U6 snRNA表达量的影响,选择四个代表性突...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１酵母的ｎ型启动子结构图??
Ｓ３??丨丨＾?ｓａ???ＩＴＳ１?＋?ＩＴＳ２?＋?＋?＋?＋?＋??ｒｅｇｉｏｎ?＾?ｒｅｇｉｏｎ?＇＾１７５４＾．?ＮＬＣ２?Ｎ￥ｕｎ?＾??５＆Ａ２Ｒ?ＩＴＳｆｌｍｕｎ?ＮＬ４Ｂ?ＮＬ６６ｍｕｎ??ＩＴＳＩＯｍｕｎ?ＩＴＳ４＿ＫＹ０１?ＮＬ３Ｂ??１ＴＳ２＿ＫＹ０１?ＩＴＳ４＿ＫＹ０２??？??ＩＴＳ２＿ＫＹ０２?ＩＴＳ４＿ＫＹ０３??Ｉ?Ｉ??Ｓｕｂｓｅｔ?１?！?．??Ｓｕｂｓｅｔ?２?．?．??Ｓｕｂｓｅｔ?３??图１．２真菌核糖体ＤＮＡ常用引物??Ｆｉｇ．１．２?Ｔｈｅ?ｃｏｍｍｏｎｌｙ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｏｆ?Ｆｕｎｇａｌ?ｒｉｂｏｓｏｍａｌ?ＤＮＡ??（引自?ＨｉｒｏｋａｚｕＴｏｊｕｄｄＰＬｏＳＯＮＥ?（２０１２，７）?７）??然而这些通用引物也并非十全十美，有研究发现通用引物存在着与目标真菌??序列不．匹配的情况，导致一些真菌亚群无法准确分类（Ｂｅｌｌｅｍａｉｎｅ纟ａ／．，?２０１０）。??例如图１．２中用于扩增ＩＴＳ１区和ＩＴＳ２区的通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ３与大多数拒子??菌门的真菌序列不配，导致一些原本属于担子菌门的真菌被??归到子囊菌门（ｄ＞ｓｃｏ／Ｋ［ｙｃｏｔｏ）和球囊菌门（＿Ｇ／ｏｗｍ？／ｗｊｃｏｔｏ）中?＿（ＢｅｌｌｅｍａｉｎＭｔ／／．，??２０１０）。Ｌｉ在鉴定棉帚霉菌ＩＴＳ１区和ＩＴＳ２区序列时发现，用多对常用的ＩＴＳ区??通用引物扩增得到的１８Ｓ和ＩＴＳ１区序列在ＮＣＢＩ上对比后无法确定其是棉帚霉??菌（＆〇评／？／７＋〇／？相客〇＆９少７＋／），．但得到的５．８Ｓ和ＩＴＳ２区序列在ＮＣＢＩ上对＿．比后可??以确定其属于帚霉属因
本研究以８００?ｂｐ的大丽轮枝菌Ｕ６启动子作为候选启动子，分段截取长度为５２７??ｂｐ、４２３?ｂｐ、３２３?ｂｐ和２３０?ｂｐ的Ｕ６启动子，截短后的Ｕ６启动子分别命名为??ＶｄＵ６－５Ｐ、ＶｄＵ６－４Ｐ、ＶｄＵ６－３Ｐ和ＶｄＵ６－２Ｐ。在大丽轮枝菌候选启动子上游设计??上游．同源臂的特异性引物（图２．２）。通过在Ｕ６启动子和Ｕ６ｓｇＲＮＡ序列上的不??同区域设计下游同源臂的特异性引物，可扩增得到不同位置的Ｄｏｗｎ片段（图??２．２），．分另１）命名为?５００?ｄｏｗｎ、４００?ｄｏｗｎ、３００?ｄｏｗｎ?和?２００?ｄｏｗｉｕ?通过一轮?ＰＣＲ??获得目的片段（图２．．３Ａ）．后，利用一步融合（Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ?ｃｌｏｎｉｎｇ）试荆＇盒将新霉素??抗牲基因与上下游同源臂连接获得目的片段（图２．３Ｂ）。对目的片段进行一轮ＰＣＲ??扩增获得大量片段（图２．３Ｃ）后与Ｔ－载体连接，得到最终的基因敲除载体。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]基因敲除技术在微生物中的应用[J]. 王雪,黄建忠,李力. 微生物学杂志. 2019(04)
[2]丝状真菌遗传转化系统的最新研究进展[J]. 赵美,王陈骄子,周而勋,舒灿伟. 基因组学与应用生物学. 2019(03)
[3]丝状真菌遗传筛选系统的研究及其应用[J]. 邓大杰,孟亚南,邓二杰,董金皋,曾凡力. 微生物学通报. 2019(05)
[4]华莱士瓜采后丝状真菌的分离及rDNA ITS区序列分析[J]. 王郅媛,姚婷,范雅为,张燕,王友升. 食品科学. 2018(20)
[5]病原物协同致病性对棉花黄萎病严重度的影响[J]. 张帆,李晓林,张敬泽,祝水金. 棉花学报. 2018(02)
[6]番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J]. 蒲艳,刘超,李继洋,阿尔祖古丽·塔什,胡燕,刘晓东. 中国农业科学. 2018(02)
[7]植物基因功能验证技术概述[J]. 杨诗怡,周小利,陈志芸,顾菁,廖菊够,陈穗云. 安徽农业科学. 2017(34)
[8]一种PCR产物克隆零背景T载体的构建[J]. 吕新,陈丽华,方志鹏,李晓琳,李玥仁. 福建农业学报. 2017(03)
[9]浙江棉花黄萎病菌致病型菌株的鉴定及高温抑制病害的表征分析[J]. 孙晓婷,鹿秀云,张敬泽,祝水金. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2016(06)
[10]棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定[J]. 雷建峰,李月,徐新霞,阿尔祖古丽·塔什,蒲艳,张巨松,刘晓东. 作物学报. 2016(05)
博士论文
[1]RNF12介导的BRF1泛素化调控RNA聚合酶Ⅲ活性的作用及机制研究[D]. 王芳.中国科学技术大学 2019
[2]基于CRISPR/Cas9的拟南芥多基因编辑及其在基因功能研究中的应用[D]. 刘玟杉.重庆大学 2015
硕士论文
[1]防治棉花黄萎病生防菌的筛选及其一个新病原菌的发现[D]. 李晓林.浙江大学 2017
[2]大丽轮枝菌一个分泌系统蛋白P-type ATPase基因的功能验证[D]. 刘娜.曲阜师范大学 2014
[3]高毒力大丽轮枝菌特异分泌蛋白基因VdSSP1的克隆和功能初步分析[D]. 柳少燕.中国农业科学院 2013
本文编号：3306601
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１酵母的ｎ型启动子结构图??
Ｓ３??丨丨＾?ｓａ???ＩＴＳ１?＋?ＩＴＳ２?＋?＋?＋?＋?＋??ｒｅｇｉｏｎ?＾?ｒｅｇｉｏｎ?＇＾１７５４＾．?ＮＬＣ２?Ｎ￥ｕｎ?＾??５＆Ａ２Ｒ?ＩＴＳｆｌｍｕｎ?ＮＬ４Ｂ?ＮＬ６６ｍｕｎ??ＩＴＳＩＯｍｕｎ?ＩＴＳ４＿ＫＹ０１?ＮＬ３Ｂ??１ＴＳ２＿ＫＹ０１?ＩＴＳ４＿ＫＹ０２??？??ＩＴＳ２＿ＫＹ０２?ＩＴＳ４＿ＫＹ０３??Ｉ?Ｉ??Ｓｕｂｓｅｔ?１?！?．??Ｓｕｂｓｅｔ?２?．?．??Ｓｕｂｓｅｔ?３??图１．２真菌核糖体ＤＮＡ常用引物??Ｆｉｇ．１．２?Ｔｈｅ?ｃｏｍｍｏｎｌｙ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｏｆ?Ｆｕｎｇａｌ?ｒｉｂｏｓｏｍａｌ?ＤＮＡ??（引自?ＨｉｒｏｋａｚｕＴｏｊｕｄｄＰＬｏＳＯＮＥ?（２０１２，７）?７）??然而这些通用引物也并非十全十美，有研究发现通用引物存在着与目标真菌??序列不．匹配的情况，导致一些真菌亚群无法准确分类（Ｂｅｌｌｅｍａｉｎｅ纟ａ／．，?２０１０）。??例如图１．２中用于扩增ＩＴＳ１区和ＩＴＳ２区的通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ３与大多数拒子??菌门的真菌序列不配，导致一些原本属于担子菌门的真菌被??归到子囊菌门（ｄ＞ｓｃｏ／Ｋ［ｙｃｏｔｏ）和球囊菌门（＿Ｇ／ｏｗｍ？／ｗｊｃｏｔｏ）中?＿（ＢｅｌｌｅｍａｉｎＭｔ／／．，??２０１０）。Ｌｉ在鉴定棉帚霉菌ＩＴＳ１区和ＩＴＳ２区序列时发现，用多对常用的ＩＴＳ区??通用引物扩增得到的１８Ｓ和ＩＴＳ１区序列在ＮＣＢＩ上对比后无法确定其是棉帚霉??菌（＆〇评／？／７＋〇／？相客〇＆９少７＋／），．但得到的５．８Ｓ和ＩＴＳ２区序列在ＮＣＢＩ上对＿．比后可??以确定其属于帚霉属因
本研究以８００?ｂｐ的大丽轮枝菌Ｕ６启动子作为候选启动子，分段截取长度为５２７??ｂｐ、４２３?ｂｐ、３２３?ｂｐ和２３０?ｂｐ的Ｕ６启动子，截短后的Ｕ６启动子分别命名为??ＶｄＵ６－５Ｐ、ＶｄＵ６－４Ｐ、ＶｄＵ６－３Ｐ和ＶｄＵ６－２Ｐ。在大丽轮枝菌候选启动子上游设计??上游．同源臂的特异性引物（图２．２）。通过在Ｕ６启动子和Ｕ６ｓｇＲＮＡ序列上的不??同区域设计下游同源臂的特异性引物，可扩增得到不同位置的Ｄｏｗｎ片段（图??２．２），．分另１）命名为?５００?ｄｏｗｎ、４００?ｄｏｗｎ、３００?ｄｏｗｎ?和?２００?ｄｏｗｉｕ?通过一轮?ＰＣＲ??获得目的片段（图２．．３Ａ）．后，利用一步融合（Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ?ｃｌｏｎｉｎｇ）试荆＇盒将新霉素??抗牲基因与上下游同源臂连接获得目的片段（图２．３Ｂ）。对目的片段进行一轮ＰＣＲ??扩增获得大量片段（图２．３Ｃ）后与Ｔ－载体连接，得到最终的基因敲除载体。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]基因敲除技术在微生物中的应用[J]. 王雪,黄建忠,李力. 微生物学杂志. 2019(04)
[2]丝状真菌遗传转化系统的最新研究进展[J]. 赵美,王陈骄子,周而勋,舒灿伟. 基因组学与应用生物学. 2019(03)
[3]丝状真菌遗传筛选系统的研究及其应用[J]. 邓大杰,孟亚南,邓二杰,董金皋,曾凡力. 微生物学通报. 2019(05)
[4]华莱士瓜采后丝状真菌的分离及rDNA ITS区序列分析[J]. 王郅媛,姚婷,范雅为,张燕,王友升. 食品科学. 2018(20)
[5]病原物协同致病性对棉花黄萎病严重度的影响[J]. 张帆,李晓林,张敬泽,祝水金. 棉花学报. 2018(02)
[6]番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J]. 蒲艳,刘超,李继洋,阿尔祖古丽·塔什,胡燕,刘晓东. 中国农业科学. 2018(02)
[7]植物基因功能验证技术概述[J]. 杨诗怡,周小利,陈志芸,顾菁,廖菊够,陈穗云. 安徽农业科学. 2017(34)
[8]一种PCR产物克隆零背景T载体的构建[J]. 吕新,陈丽华,方志鹏,李晓琳,李玥仁. 福建农业学报. 2017(03)
[9]浙江棉花黄萎病菌致病型菌株的鉴定及高温抑制病害的表征分析[J]. 孙晓婷,鹿秀云,张敬泽,祝水金. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2016(06)
[10]棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定[J]. 雷建峰,李月,徐新霞,阿尔祖古丽·塔什,蒲艳,张巨松,刘晓东. 作物学报. 2016(05)
博士论文
[1]RNF12介导的BRF1泛素化调控RNA聚合酶Ⅲ活性的作用及机制研究[D]. 王芳.中国科学技术大学 2019
[2]基于CRISPR/Cas9的拟南芥多基因编辑及其在基因功能研究中的应用[D]. 刘玟杉.重庆大学 2015
硕士论文
[1]防治棉花黄萎病生防菌的筛选及其一个新病原菌的发现[D]. 李晓林.浙江大学 2017
[2]大丽轮枝菌一个分泌系统蛋白P-type ATPase基因的功能验证[D]. 刘娜.曲阜师范大学 2014
[3]高毒力大丽轮枝菌特异分泌蛋白基因VdSSP1的克隆和功能初步分析[D]. 柳少燕.中国农业科学院 2013
本文编号：3306601
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