罗非鱼源维氏气单胞菌的分离鉴定及基因分型研究

发布时间：2017-04-27 21:04

  本文关键词：罗非鱼源维氏气单胞菌的分离鉴定及基因分型研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：海南自然环境适宜,水质优良,是我国罗非鱼(Oreochromis niloticus)主要养殖区域之一,产量位居全国第二,海南养殖的罗非鱼及其制品多用于出口,2011、2012年连续两年出口量位居全国第一,平均年出口量达到9.88万吨。但随着养殖面积不断扩大和产量不断提高,罗非鱼病害越来越多,暴发范围越来越大,其中细菌性疾病尤为严重,给罗非鱼养殖业带来了巨大的经济损失。维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种新型的人-畜-鱼共患病病原菌,广泛的存在于土壤、自然水体、养殖水体中。近年来,其感染的水产动物种类越来越多,传播范围非常广泛。目前,国内有关罗非鱼源维氏气单胞菌患病的报道很少,在海南还未发现维氏气单胞菌感染罗非鱼的报道。2014年3-5月海南省罗非鱼主养区多个养殖场发生暴发性疾病,作者从海南罗非鱼养殖场患病个体中分离出优势菌,进行人工回归感染试验,并采用生理生化和16SrRNA序列分析,确定此次罗非鱼暴发性疾病病原菌为维氏气单胞菌。鉴于维氏气单胞菌的对人具有潜在致病性,作者对市场、养殖场及天然池塘中的罗非鱼进行检测,从不同来源罗非鱼体内分离获得40株维氏气单胞菌,之后对这40株维氏气单胞菌进行8种毒力基因的分布情况研究,并根据不同菌株间毒力基因的差异以及采用ERIC-PCR技术进行基因分型研究。具体研究方法和结果如下： 2014年3-5月海南省罗非鱼主养区多个养殖场发生暴发性疾病,从患病罗非鱼不同组织中分离获得12株优势菌。经人工回归感染实验,从肝脏和脑中分离获得的HN-G-03和HN-B-02菌株具较强的致病力,HN-G-03和HN-B-02菌株对罗非鱼的的半致死浓度LDso分别为7.12×105CFU/尾和1.32×105CFU/尾。经16SrRNA和gyrB基因序列分析,同时结合细菌的形态学特征,生理生化特征,菌株HN-G-03和HN-B-02分别被鉴定为维氏生物型维氏气单胞菌和温和生物型维氏气单胞菌。体外药物药敏试验结果显示,两株菌均对左氧氟沙星、强力霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、庆大霉素等5种药物高度敏感,对呋喃妥因等3种药物中度敏感,对青霉素等12种药物呈较强的耐药性。 2014年5-8月期间,从海南罗非鱼养殖场、市场、野生池塘等6个地点采集罗非鱼,利用气单胞菌选择性培养基RS从罗非鱼体内分离出疑似气单胞菌152株,通过氧化酶、接触酶、O/F实验进行初筛,然后将三个生化指标全是阳性的菌株通过气单胞菌属特定的16S rDNA引物进行确认,共筛选出71株,最后利用gyrB基因序列分析确定其中40株为维氏气单胞菌。对40株维氏气单胞菌的细胞毒性肠毒素act、细胞兴奋性肠毒素aJt、热稳定性肠毒素ast、气溶素aerA、溶血素hlyA、脂肪酶lip、鞭毛基因fla以及菌毛基因tapA8种毒力基因进行检测。其中aerA和tapA的阳性检出率率为0,act阳性率为35%,alt阳性率为22.5%,ast阳性率为27.5%,hlyA阳性率为15%,lip阳性率为5%,fla阳性率为37.5%。40株维氏气单胞菌中,act+alt+ast+毒力基因型菌株阳性率为7.7%,随机带有1个或2个肠毒素基因的菌株阳性率为50%。 基于毒力基因的分布情况,采用平均连锁法(UPGMA)构建聚类树状图,结果可将40株维氏气单胞菌分为14个毒力基因型,8个簇,其中Ⅷ型数量最多,有15株,来自于养殖环境与野生环境的菌株毒力基因呈明显的随机交叉分布；利用ERIC-PCR技术对40株维氏气单胞菌进行基因分型,ERIC电泳图显示主条带有4种,大小范围在800-6000bp之内,采用NTSYS2.1pc软件构建遗传相似图,以遗传相似度90%为界可将分离菌株分为18个基因型,其中有8株菌呈独立的基因型存在,按来源分类,养殖鱼源与野生鱼源的指纹图谱呈明显混合式分布。
【关键词】：罗非鱼 维氏气单胞菌 gyrB基因 毒力基因 ERIC-PCR
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 综述11-20
• 1 海南罗非鱼养殖概况11
• 2 罗非鱼主要细菌性疾病11-13
• 2.1 罗非鱼生物学特性11
• 2.2 罗非鱼细菌性疾病简介11-12
• 2.3 罗非鱼细菌性疾病的防治12-13
• 3 维氏气单胞菌研究进展13-16
• 3.1 维氏气单胞菌的分类地位13
• 3.2 维氏气单胞菌的生物学特征13-14
• 3.3 维氏气单胞菌的致病性及流行性14-16
• 3.3.1 维氏气单胞菌的致病性14-15
• 3.3.2 维氏气单胞菌的分布及流行情况15
• 3.3.3 维氏气单胞菌的主要毒力基因15-16
• 4 管家基因序列鉴定和分析16-17
• 4.1 gyrB基因简介16-17
• 4.2 gyrB基因在细菌鉴定与分类中的应用17
• 5 ERIC-PCR基因分型17-19
• 5.1 基因分型简介17-18
• 5.2 ERIC-PCR指纹图谱技术简介18
• 5.3 ERIC-PCR的应用18-19
• 6 本文的目的和意义19-20
• 第二章 海南罗非鱼致病性维氏气单胞菌的分离、纯化和鉴定20-39
• 1 材料与方法20-28
• 1.1 实验材料20
• 1.2 主要试剂与培养基20-22
• 1.2.1 主要试剂及其配制20-21
• 1.2.2 主要培养基及其配置21
• 1.2.3 主要仪器21-22
• 1.3 实验方法22-28
• 1.3.1 病原菌的分离纯化与培养22
• 1.3.2 人工感染实验22-23
• 1.3.3 病原菌对罗非鱼半数致死剂量LD50的计算23
• 1.3.4 病原菌的革兰氏染色23
• 1.3.5 细菌DNA的提取23-24
• 1.3.6 病原菌16S rRNA基因序列分析及系统发育树构建24-27
• 1.3.7 管家基因gyrB基因序列分析及系统发育树构建27
• 1.3.8 生理生化鉴定27-28
• 1.3.9 药敏实验28
• 2 结果与分析28-36
• 2.1 患病罗非鱼症状与病原菌形态学观察28-29
• 2.2 人工感染实验29
• 2.3 病原菌LD50的测定29-30
• 2.4 16S rRNA基因序列分析与系统发育树的构建30-32
• 2.5 管家基因gyrb序列分析及系统发育树构建32-33
• 2.6 生理生化特性33-35
• 2.7 药敏试验35-36
• 3 讨论36-39
• 第三章 罗非鱼源维氏气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分布研究39-53
• 1 材料与方法39-44
• 1.1 实验材料39-40
• 1.1.1 菌株及罗非鱼来源39-40
• 1.2 主要试剂及仪器40-41
• 1.2.1 主要试剂及其配制40
• 1.2.2 主要仪器40-41
• 1.3 实验方法41-44
• 1.3.1 维氏气单胞菌的分离纯化与保存41
• 1.3.2 维氏气单胞菌的初步筛选41
• 1.3.3 细菌DNA模板的制备41
• 1.3.4 气单胞菌的分子鉴定41-42
• 1.3.5 gyrB基因序列扩增及测序42
• 1.3.6 维氏气单胞菌毒力基因检测42-44
• 2 结果44-50
• 2.1 细菌的分离44-45
• 2.2 病原菌的初步筛选45
• 2.3 气单胞菌的分子标记鉴定45
• 2.4 维氏气单胞菌的gyrB基因鉴定45-46
• 2.5 维氏气单胞菌毒力基因的检测46-50
• 3 讨论50-53
• 第四章 维氏气单胞菌的基因分型53-60
• 1 材料与方法53-54
• 1.1 实验材料53
• 1.2 主要试剂及仪器53
• 1.2.1 主要试剂及其配制53
• 1.2.2 主要仪器53
• 1.3 实验方法53-54
• 1.3.1 基于毒力基因的基因分型53
• 1.3.2 ERIC-PCR53-54
• 1.3.3 数据处理54
• 2 结果54-58
• 2.1 维氏气单胞菌毒力基因聚类分析图(UPGMA)54-56
• 2.2 不同来源维氏气单胞菌毒力基因聚类图分析56
• 2.3 维氏气单胞菌ERIC-PCR扩增片段56
• 2.4 维氏气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱聚类树状图(UPGMA)56-58
• 3 讨论58-60
• 参考文献60-69
• 作者攻读学位期间论文发表情况69-70
• 致谢70

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