两品种鸭法氏囊差异表达基因、miRNA的富集及验证

发布时间：2017-04-28 10:04

  本文关键词：两品种鸭法氏囊差异表达基因、miRNA的富集及验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：遗传效应是决定动物机体抗病力强弱的主要因素之一。有资料表明,地方鸭品种往往比经过系统选育的肉鸭品种表现出更强的抗病力,二者在不同阶段免疫器官的发育也存在差异,免疫相关指标所反映出的抗逆能力也不尽相同。为研究地方鸭和培育鸭品种在抗病力上存在差异的原因,拟以建昌鸭(JCH)和农华肉鸭(PK)为试验对象,构建建昌鸭和农华肉鸭4周龄法氏囊混合组织样(JCF、PKF)的数字基因表达谱(DGE),并进行小RNA测序,获得两品种鸭法氏囊组织中的差异表达基因及miRNA,采用qRT-PCR技术对筛选出的部分差异表达基因和miRNA进行验证,并将二者进行联合分析,试图找到影响两品种鸭抗病能力的关键基因及关键miRNA,为鸭的免疫调控机制及抗病育种研究提供参考。试验结果表明：DGE结果中,JCF共获得18870755个reads,经过滤得到18438616个clean reads; PKF共获得14281414个reads,经过滤得到13983876个clean reads。相对于PKF, JCF有95个表达上调基因、100个表达下调基因。通过对差异表达基因的GO (Gene ontology)分析,发现差异表达基因主要被富集到蛋白代谢、高分子代谢及核糖体组分中；通过差异基因的KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,发现在剪切体相关通路、RNA转运过程、RNA降解过程、Jak-STAT信号通路、TNF信号通路及B细胞受体信号通路等均有差异基因富集。筛选出差异显著的与免疫相关的10个差异表达基因并对其进行qRT-PCR验证。通过检测这些基因在JCF中3、4、5周龄(W3、W4、W5)时对于PKF相对表达量的变化倍数,发现W3时有7个基因相对表达量的变化趋势与预测结果一致,W4和W5时仅有3个基因的验证结果与预测结果一致。小RNA测序在JCF和PKF中分别获得11496755和11962192个reads,经过滤分别得到8234150和8105240个clean reads。相对于PKF, JCF中总共筛选出23个上调miRNAs、41个下调miRNAs。JCF中预测到的新miRNA有26种,PKF中有27种。通过对miRNA候选靶基因进行GO分析,靶基因主要在细胞组分被富集,通过KEGG分析,结果发现在代谢通路有最多的靶基因被富集,其他如癌症信号通路、肠道生成IgA的免疫网络、细胞因子间受体互作及甲型流感等通路中均有显著的靶基因被注释。对筛选出的差异最为显著的10个miRNA进行qRT-PCR验证。通过检测JCF中差异miRNA对于PKF相对表达量的变化倍数,结果发现W3、W4、W5时均有7个及以上的miRNA的变化趋势与预测结果一致。通过对差异表达基因和差异miRNA进行联合分析,发现差异miRNA的表达发生变化时,对应的靶基因的表达均发生显著变化。GO分析结果显示miRNA的靶基因主要富集到代谢过程,KEGG富集分析发现niRNA的靶基因主要富集在核糖体信号通路、内质网蛋白过程及RNA降解过程中。综上所述,建昌鸭和农华肉鸭的法氏囊组织中筛选到195个差异表达基因、64个差异niRNA,以及差异表达基因和miRNA靶基因在多个分子过程和免疫应答相关信号转导途径如抗原加工与呈递、细胞因子间受体互作及B细胞受体信号等通路是构成两品种鸭法氏囊功能差异的基础。以上研究为进一步揭示鸭的免疫调控机制奠定基础。
【关键词】：鸭 法氏囊 数字基因表达谱 小RNA测序
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S834
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12
• 1 文献综述12-26
• 1.1 法氏囊12-18
• 1.1.1 组织结构13
• 1.1.2 发育特点13-15
• 1.1.3 法氏囊的免疫功能15-18
• 1.2 与法氏囊免疫功能相关的重要基因及miRNA18-22
• 1.2.1 影响法氏囊发育、功能的主要基因18-20
• 1.2.2 参与免疫调控的miRNA20-22
• 1.3 高通量技术在禽类免疫基因富集中的应用22-24
• 1.4 遗传背景不同与免疫功能差异24-25
• 1.5 研究目的和意义25-26
• 2 材料与方法26-35
• 2.1 试验材料26-27
• 2.1.1 试验动物26
• 2.1.2 试剂与设备26-27
• 2.2 试验方法27-35
• 2.2.1 样品的制备27-28
• 2.2.2 数字基因表达谱的构建28-30
• 2.2.3 DEG差异表达基因的验证30-31
• 2.2.4 Small RNA测序31-33
• 2.2.5 差异miRNA的验证33-34
• 2.2.6 差异miRNA与差异DGE的联合分析34-35
• 2.3 数据处理35
• 3 结果与分析35-57
• 3.1 RNA提取效果35-36
• 3.2 差异表达基因富集及验证36-44
• 3.2.1 测序质量及序列比对统计结果36
• 3.2.2 Reads与参考基因组比对情况统计36-37
• 3.2.3 RNA-seq整体质量评估37-39
• 3.2.4 差异表达基因的筛选39-40
• 3.2.5 差异基因GO分析40-41
• 3.2.6 差异基因KEGG分析41-42
• 3.2.7 差异表达基因验证42-44
• 3.3 差异表达miRNA富集及验证44-54
• 3.3.1 测序质量的评估及小RNA长度分布44
• 3.3.2 miRNA公共及特有序列分析44-45
• 3.3.3 碱基偏好性分布45-46
• 3.3.4 小RNA分类注释统计46-47
• 3.3.5 样品间相关性检查47-48
• 3.3.6 miRNA差异表达分析结果48-50
• 3.3.7 差异miRNA靶基因功能富集分析50-52
• 3.3.8 差异表达miRNA验证52-54
• 3.4 差异miRNA与差异DGE的联合分析54-57
• 3.4.1 miRNA-mRNA的关联分析54-55
• 3.4.2 miRNA靶基因与差异表达基因的联合GO分析55-56
• 3.4.3 miRNA靶基因与差异表达基因的联合KEGG富集分析56-57
• 4 讨论57-64
• 4.1 两品种鸭法氏囊功能差异的基因和miRNA57-59
• 4.2 两品种鸭法氏囊功能差异的分子过程59-60
• 4.3 基于差异表达基因和差异miRNA的主要信号通路60-62
• 4.4 本研究的不足和后续改进62-64
• 5 结论64-65
• 参考文献65-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间发表的学术论文75

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