桑树韧皮部汁液蛋白质的鉴定及Mul-BRD1蛋白的功能研究
发布时间：2021-08-08 16:32
桑树是家蚕的主要饲料树种,且有很高的生态价值、经济价值和药用价值。盐和干旱是影响桑树生长的重要环境因素,提高桑树抵抗逆境胁迫的能力有利于促进蚕业生产发展和桑树生态价值、经济价值和药用价值的实现。桑树韧皮部汁液中含有丰富的蛋白质,在信号传递、物质运输和植物防御等方面具有重要作用。因此,对韧皮部汁液蛋白质进行鉴定并对其功能进行研究,有助于揭示桑树的抗逆机制,为桑树抗性育种提供候选基因。本课题对桑树韧皮部汁液蛋白质组进行了高通量分析,对鉴定到的溴结构域蛋白（Bromodomain-containing protein 1）基因（Mul-BRD1）进行了克隆,并对其表达特性和生物学功能进行了研究,同时筛选鉴定出了Mul-BRD1蛋白的相互作用蛋白质。研究结果有助于深入了解植物韧皮部的功能及其对环境响应的分子机制和信号传导途径,为桑树抗性育种提供了候选基因,同时也为深入研究Mul-BRD1基因的作用机制奠定了基础。本研究的主要结果如下:（1）桑树韧皮部汁液蛋白质组研究利用液相色谱-串联质谱技术对桑树韧皮部汁液蛋白质组进行了高通量分析,鉴定了712种蛋白质,其功能可分为20类,其中最丰富的类别是与...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：115 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
溴结构域蛋白的分类（Filippakopoulosetal.,2012）
山东农业大学硕士学位论文23凝胶进行电泳检测，并用胶回收试剂盒回收所酶切的目的DNA条带。将DNA目的片段与经过同样双酶切的植物表达载体pBI121相连接，连接反应体系如下：将上述反应液加入到已灭菌的250μL离心管中，通过移液枪吹吸混匀，16C过夜连接12h。取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，用涂布器涂布于含有卡那霉素（Kan+）抗生素的固体LB培养基中过夜培养，挑取单克隆进行菌液PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件同2.2.2.3，筛选阳性菌株。获得阳性质粒后测序。图2-1植物表达载体pBI121-Mul-BRD1构建示意图Fig.2-1ConstructionofplantexpressionvectorpBI121-Mul-BRD12.2.3.3植物表达载体pROKII-MulBRD1-GFP的构建根据该基因的核苷酸序列信息，设计含有酶切位点的特异性引物Mul-BRD1-5"（BamHI）和Mul-BRD1-3"（KpnI），并用带有酶切位点的引物，以阳性质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件和体系同2.2.2.3，回收目的基因片段，连接克隆载体pMD19-T并转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR筛选阳性克隆，扩增体系和条件同2.2.2.3，按照步骤2.2.3.1提取阳性质粒，进行双酶切，双酶切反应以及表达载体与目的片段连反应液体积目的DNA片段（50ng/μL）5.5μL酶切后质粒载体（21ng/μL）2.0μLT4Buffer2.0μLT4DNA连接酶（10U/μL）0.5μLTotal10.0μLSalⅠ35SpromoteroriKanrBamHⅠMul-BRD1SalⅠ35SpromoteroriKanrGUSBamHIpBI121T4LigaseBamHⅠSalⅠMul-BRD1BamHⅠ+SalⅠpBI121-Mul-BRD1
桑树韧皮部汁液蛋白质的鉴定及Mul-BRD1蛋白的功能研究24接转化获得阳性质粒体系同2.2.3.2。图2-2植物表达载体pROKII-MulBRD1-GFP构建示意图Fig.2-2ConstructionofplantexpressionvectorpROKII-MulBRD1-GFP2.2.4转基因拟南芥的获得2.2.4.1农杆菌GV3101感受态细胞的转化（1）从-80C冰箱中取保存的农杆菌GV3101感受态细胞，置于冰上融化。（2）在超净工作台中操作，吸取40μL感受态细胞放于干净的1.5mL离心管中，向其加入适量重组质粒DNA，用移液枪轻轻吹吸混匀，在冰盒上静置30min。（3）将液氮倒入保温桶中，随后立即用液氮处理加入重组质粒的感受态细胞1min，再于37℃中水浴5min。（4）在超净工作台上，向离心管中加入960μL不含任何抗生素的LB液体培养基，28C恒温震荡培养箱，250rpm培养3h，室温，7000g离心1min，弃上清，加入100μLLB液体培养基吸打沉淀，悬浮菌体。（5）吸取40μL悬浮细胞涂布于含50mg/LKan+的LB固体培养皿上，28C倒置培养36-48h。（6）挑取单个菌落接种于含有400μLLB（50mg/LKan+）液体培养基的1.5mL离心管中，于28C培养箱震荡培养5-7h。（7）菌液PCR检测：以1μL培养的菌液为模板，进行菌液PCR鉴定，反应体系同2.2.2.3。（8）选取得到的阳性克隆菌液，接种于含有10mLLB（50mg/LKan+）液体培养基的50mL锥形瓶中过夜培养14-16h后加甘油保存菌种（菌液:甘油=3:1），于-80C保KpnⅠ35SpromoteroriBamHⅠMul-BRD1BamHⅠ35SpromoteroriEGFPKpnⅠpROKIIT4LigaseBamHⅠKpnⅠMul-BRD1BamHⅠ+KpnⅠpROKII-MulBRD1-GFPEGFP
【参考文献】：
期刊论文
[1]BRD4-DNA相互作用促进双共价的染色质结合[J]. 谷锐锐,韩欣冶,喻笛,贾艳杰,王琪,曾雷. 中国生物化学与分子生物学报. 2020(05)
[2]水稻响应缺铁的韧皮部汁液蛋白质组学分析[J]. 陈琳,林焱,陈鹏飞,王绍华,丁艳锋. 植物学报. 2019(02)
[3]芹菜韧皮部蛋白质AgPP2-2基因的克隆与表达[J]. 贾晓玲,王枫,马静,刘君,徐馨琰,熊爱生. 江苏农业学报. 2014(02)
[4]乙酰转移酶MYST家族的生物学功能[J]. 黄国滨,刘新光,陈维春. 中国生物化学与分子生物学报. 2014(03)
博士论文
[1]溴结构域蛋白BRD4维持胃癌细胞高侵袭转移特性的作用及机制研究[D]. 覃中毅.中国人民解放军陆军军医大学 2019
[2]南瓜韧皮液mRNA结合蛋白的纯化与CmRBP50核糖核蛋白复合体形成的分子机制[D]. 李苹芳.浙江大学 2011
硕士论文
[1]桑树韧皮部汁液mul-miR482和mul-miR58的生物学功能研究[D]. 郭方月.山东农业大学 2015
[2]桑树韧皮部汁液植原体响应基因的研究[D]. 袁传忠.山东农业大学 2014
本文编号：3330297
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：115 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
溴结构域蛋白的分类（Filippakopoulosetal.,2012）
山东农业大学硕士学位论文23凝胶进行电泳检测，并用胶回收试剂盒回收所酶切的目的DNA条带。将DNA目的片段与经过同样双酶切的植物表达载体pBI121相连接，连接反应体系如下：将上述反应液加入到已灭菌的250μL离心管中，通过移液枪吹吸混匀，16C过夜连接12h。取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，用涂布器涂布于含有卡那霉素（Kan+）抗生素的固体LB培养基中过夜培养，挑取单克隆进行菌液PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件同2.2.2.3，筛选阳性菌株。获得阳性质粒后测序。图2-1植物表达载体pBI121-Mul-BRD1构建示意图Fig.2-1ConstructionofplantexpressionvectorpBI121-Mul-BRD12.2.3.3植物表达载体pROKII-MulBRD1-GFP的构建根据该基因的核苷酸序列信息，设计含有酶切位点的特异性引物Mul-BRD1-5"（BamHI）和Mul-BRD1-3"（KpnI），并用带有酶切位点的引物，以阳性质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件和体系同2.2.2.3，回收目的基因片段，连接克隆载体pMD19-T并转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR筛选阳性克隆，扩增体系和条件同2.2.2.3，按照步骤2.2.3.1提取阳性质粒，进行双酶切，双酶切反应以及表达载体与目的片段连反应液体积目的DNA片段（50ng/μL）5.5μL酶切后质粒载体（21ng/μL）2.0μLT4Buffer2.0μLT4DNA连接酶（10U/μL）0.5μLTotal10.0μLSalⅠ35SpromoteroriKanrBamHⅠMul-BRD1SalⅠ35SpromoteroriKanrGUSBamHIpBI121T4LigaseBamHⅠSalⅠMul-BRD1BamHⅠ+SalⅠpBI121-Mul-BRD1
桑树韧皮部汁液蛋白质的鉴定及Mul-BRD1蛋白的功能研究24接转化获得阳性质粒体系同2.2.3.2。图2-2植物表达载体pROKII-MulBRD1-GFP构建示意图Fig.2-2ConstructionofplantexpressionvectorpROKII-MulBRD1-GFP2.2.4转基因拟南芥的获得2.2.4.1农杆菌GV3101感受态细胞的转化（1）从-80C冰箱中取保存的农杆菌GV3101感受态细胞，置于冰上融化。（2）在超净工作台中操作，吸取40μL感受态细胞放于干净的1.5mL离心管中，向其加入适量重组质粒DNA，用移液枪轻轻吹吸混匀，在冰盒上静置30min。（3）将液氮倒入保温桶中，随后立即用液氮处理加入重组质粒的感受态细胞1min，再于37℃中水浴5min。（4）在超净工作台上，向离心管中加入960μL不含任何抗生素的LB液体培养基，28C恒温震荡培养箱，250rpm培养3h，室温，7000g离心1min，弃上清，加入100μLLB液体培养基吸打沉淀，悬浮菌体。（5）吸取40μL悬浮细胞涂布于含50mg/LKan+的LB固体培养皿上，28C倒置培养36-48h。（6）挑取单个菌落接种于含有400μLLB（50mg/LKan+）液体培养基的1.5mL离心管中，于28C培养箱震荡培养5-7h。（7）菌液PCR检测：以1μL培养的菌液为模板，进行菌液PCR鉴定，反应体系同2.2.2.3。（8）选取得到的阳性克隆菌液，接种于含有10mLLB（50mg/LKan+）液体培养基的50mL锥形瓶中过夜培养14-16h后加甘油保存菌种（菌液:甘油=3:1），于-80C保KpnⅠ35SpromoteroriBamHⅠMul-BRD1BamHⅠ35SpromoteroriEGFPKpnⅠpROKIIT4LigaseBamHⅠKpnⅠMul-BRD1BamHⅠ+KpnⅠpROKII-MulBRD1-GFPEGFP
【参考文献】：
期刊论文
[1]BRD4-DNA相互作用促进双共价的染色质结合[J]. 谷锐锐,韩欣冶,喻笛,贾艳杰,王琪,曾雷. 中国生物化学与分子生物学报. 2020(05)
[2]水稻响应缺铁的韧皮部汁液蛋白质组学分析[J]. 陈琳,林焱,陈鹏飞,王绍华,丁艳锋. 植物学报. 2019(02)
[3]芹菜韧皮部蛋白质AgPP2-2基因的克隆与表达[J]. 贾晓玲,王枫,马静,刘君,徐馨琰,熊爱生. 江苏农业学报. 2014(02)
[4]乙酰转移酶MYST家族的生物学功能[J]. 黄国滨,刘新光,陈维春. 中国生物化学与分子生物学报. 2014(03)
博士论文
[1]溴结构域蛋白BRD4维持胃癌细胞高侵袭转移特性的作用及机制研究[D]. 覃中毅.中国人民解放军陆军军医大学 2019
[2]南瓜韧皮液mRNA结合蛋白的纯化与CmRBP50核糖核蛋白复合体形成的分子机制[D]. 李苹芳.浙江大学 2011
硕士论文
[1]桑树韧皮部汁液mul-miR482和mul-miR58的生物学功能研究[D]. 郭方月.山东农业大学 2015
[2]桑树韧皮部汁液植原体响应基因的研究[D]. 袁传忠.山东农业大学 2014
本文编号：3330297
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