几种海洋经济动物种质资源超低温冷冻保存研究

发布时间：2017-04-28 17:18

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【摘要】：种质资源是海水养殖生产、优良品种培育及海洋渔业可持续发展的重要物质基础。然而,随着海水养殖业的快速发展,海洋动物核心种质鉴定和保护研究严重滞后的负面效应日益突出。超低温保存技术是种质细胞长期保存的重要方法,相关理论与技术的发展,对于种质资源的保护、遗传改良以及养殖业的可持续发展有着重要应用价值和理论意义。1.太平洋鳕精液超低温冷冻采用分步降温法冷冻保存太平洋鳕(Gadus macrocephalus)精液,并用扫描电镜和透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤。分析了添加剂(蛋黄)及五种抗冻剂(PG(丙二醇)、DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇))不同浓度(8%、10%、12%、14%、16%、18%)对太平洋鳕精子冷冻保存效果的影响。实验结果表明,蛋黄能够显著提高太平洋鳕冷冻保存效果(P0.05)；在以HBSS为稀释液,12%PG中添加10%蛋黄保存的冻融精子运动率最高(85.87%±1.6%),显著高于其他冻存组(P0.05)。添加蛋黄的12%浓度的DMSO组解冻后精子运动速率较高,平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到了(120.39±20.78)μm/s、(120.39±20.78)μm/s、 (155.64±12.02)μm/s,与其他各实验组差异显著(P0.05)。通过扫描电镜和透射电镜观察新鲜和冻融后的鳕鱼精子发现,鲜精中75.5%精子形态结构正常、24.5%精子形态结构异常；运动率最高的冻精中67%精子形态结构正常、33%精子形态结构异常。超低温保存对太平洋鳕精子结构产生了显著影响,细胞膜破裂、线粒体肿胀变形,鞭毛脱落、断裂。2.条纹锯洦精液超低温冷冻保存研究为建立条纹锯洦(Centropristis striata)精液超低温冷冻保存方法,实验采用计算机辅助精子分析系统(CASA)分析了六种抗冻保护剂(GLY[甘油]、DMSO[二甲基亚砜]、PG[丙二醇]、EG[乙二醇]、MeOH[甲醇]、DMA[二甲基乙酰胺])在四种不同浓度下(5、]0、]5、20%,v/v)对条纹锯洦精液冷冻保存的效果。结果显示：以HBSS为稀释液,采用程序降温仪分步降温冷冻保存条纹锯洦精液,37℃水浴解冻后的精子中,15%PG作为抗冻保护剂的精子运动率最高,达到93.1±0.9%,与鲜精差异不显著(P0.05),15%PG作为抗冻保护剂的精子水浴解冻后精子的运动速度最高,平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到了(88,3±0.3)μm/s、(76.2±0.5)μm/s、 (86.7±0.7)μm/s,与鲜精差异不显著(P0.05)。在不同种类及不同浓度抗冻保护剂保护下,15%PG作为抗冻保护剂的精子解冻后1mmin内运动率变化与鲜精差异不显著(P0.05)。研究表明,15%PG为条纹锯洦最佳抗冻保护剂,可用于条纹锯洦精液的超低温冷冻保存。3.太平洋牡蛎精液的超低温保存研究本研究筛选了六种抗冻保护剂(GLY[甘油],DMSO[二甲基亚砜],PG[丙二醇],EG[乙二醇],DMA[二甲基乙酰胺],MeOH[甲醇])及其五种不同浓度(6%,8%,10%,12%,14%,V/V)、三种稀释液(无钙HBSS,人工海水[ASW],过滤海水[FSW])、四种稀释比例(1：1,1：2,1：4,1：6)、三种添加剂(蔗糖,葡萄糖,海藻糖)、三个分步降温程序(程序A,程序B,程序C)对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)精液冷冻保存的影响,成功建立了太平洋牡蛎精液超低温保存方法：以10%DMSO为抗冻保护剂,无钙HBSS为稀释液,1：4的稀释比例,添加0.45mol/L的海藻糖,采用分布降温法冷冻保存太平洋牡蛎的精液,37℃水浴解冻后精液运动率达到71.27%±3.24%,显著高于其它实验组(P0.05),受精率和孵化率分别达到95.04%±1.99%、93.33%±1.33%,与鲜精(88.89%±15.16%,94.90%±0.95%)、程序冷冻前精液(95.96%±2.15%,92.67%±14.83%)差异不显著(P0.05),证明该太平洋牡蛎精液超低温保存方法可以应用于生产实践和科学研究中。4.太平洋牡蛎精子超低温冷冻后超微结构损伤研究采用程序降温仪分步降温冷冻保存太平洋牡蛎精液,并用扫描电镜、透射电镜研究了精子的超微结构损伤。超低温冷冻保存后太平洋牡蛎精子的运动率、受精率及孵化率与鲜精无显著差异。鲜精中84.5%的精子形态结构正常,冻精中73%的精子形态结构正常。形态结构正常的精子表现为顶体、质膜、线粒体与鞭毛结构完整、染色质形状规则,顶体、线粒体及中心粒结构正常,鞭毛形态完整、微管结构清晰；形态结构异常的精子表现为顶体脱落、解体,精子头部质膜膨胀、破裂、染色质肿胀、破裂、解体,线粒体移位、脱落、膨胀,嵴退化或消失,鞭毛弯折、断裂,微管解聚。结果显示,以10% DMSO为抗冻保护剂,HBSS溶液为稀释液,1：4的稀释比例,添加海藻糖,采用分步降温法冷冻保存,对太平洋牡蛎精子具有较好的抗冻保护作用,合适的冻存方法可以有效的保护太平洋牡蛎精子冷冻过程中结构损伤。本研究将有助于太平洋牡蛎种质资源的收集保存及应用。5.太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温保存研究本实验研究了六种抗冻保护剂GLY(甘油)、DMSO(二甲基亚砜)、PG(丙二醇)、EG(乙二醇)、DMA(二甲基乙酰胺)和MET(甲醇)在三种不同浓度下(5%、10%、15%,v/v)对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用及冷冻保存的影响。太平洋牡蛎担轮幼虫毒性实验证明：抗冻保护剂的种类和浓度对太平洋牡蛎担轮幼虫产生的毒性强弱不同,在抗冻保护剂浓度为5%时,GLY、DMSO、 PG、EG对太平洋牡蛎的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P0.05)；随着抗冻保护剂浓度增加到10%,GLY、DMSO、EG、MET对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P0.05)；而抗冻保护剂浓度为15%时,GLY、DMSO对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P0.05),且随着抗冻保护剂浓度的升高,其对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用也增大。太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温冷冻保存实验证明：以10% DMSO作为抗冻保护剂,采用分步降温法冷冻保存太平洋牡蛎担轮幼虫,28℃水浴解冻后担轮幼虫运动率达到(73.00±2.00)%,显著高于其他实验组(P0.05),其次为GLY组,且各浓度间差异不显著(P0.05)。该研究为太平洋牡蛎及其他贝类胚胎保存提供了科学依据,在贝类遗传育种和生物技术等方面具有一定的应用前景,具有重要的生产实践价值。
【关键词】：海洋动物 种质 精子 胚胎 超低温冷冻保存
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-15
• 前言15-17
• 第一章 文献综述17-28
• 1. 海洋动物种质冷冻保存研究意义17-19
• 2. 海洋动物种质超低温保存的研究现状19-24
• 2.1 鱼类精子冷冻保存技术研究现状20
• 2.2 贝类精子冷冻保存技术研究现状20-21
• 2.3 海水鱼类胚胎冷冻保存技术研究现状21-23
• 2.4 贝类胚胎和卵子冷冻保存技术研究现状23-24
• 3. 冷冻保存对海洋动物种质质量影响的研究现状24-25
• 4. 冷冻保存对种质形态结构的影响25-26
• 5. 冷冻保存时间对种质生理活性的影响26
• 6. 本研究的内容和意义26-28
• 第二章 太平洋鳕精液超低温冷冻方法的建立及精子超微结构分析28-40
• 1. 材料和方法28-29
• 1.1 样品采集28
• 1.2 实验方法28-29
• 1.3 鲜精与冻精的活力测定29
• 1.4 鲜精与冻精的超微结构观察29
• 1.5 数据处理29
• 2. 结果29-36
• 2.1 添加剂蛋黄对精子运动率的作用29-31
• 2.2 抗冻剂种类和浓度对运动率的影响31
• 2.3 抗冻剂种类和浓度对精子活力的影响31-34
• 2.4 抗冻剂种类和浓度对运动率的影响34-36
• 2.4.1 扫描电镜观察结构正常和异常的精子34-35
• 2.4.2 透射电镜观察结构正常和结构异常的精子35-36
• 3. 讨论36-39
• 3.1 抗冻剂种类和浓度对运动率的影响36-37
• 3.2 抗冻剂种类和浓度对精子活力的影响37-38
• 3.3 抗冻剂种类和浓度对精子运动速度的影响38
• 3.4 太平洋鳕鲜精及冻精的超微结构38-39
• 4. 小结39-40
• 第三章 条纹锯洦精液超低温冷冻保存研究40-49
• 1 材料和方法40-41
• 1.1 样品采集40
• 1.2 实验方法40-41
• 1.3 鲜精与冻精的活力测定41
• 1.4 数据处理41
• 2 结果41-45
• 2.1 抗冻剂种类和浓度对精子运动率的影响41-42
• 2.2 抗冻剂种类和浓度对精子运动性能的影响42-44
• 2.3 不同浓度不同种类的抗冻剂对精子激活后运动率的影响44-45
• 3 讨论45-49
• 3.1 抗冻剂种类和浓度对精子运动率的影响45-46
• 3.2 抗冻剂种类和浓度对精子运动速度的影响46-47
• 3.3 不同浓度和种类抗冻剂激活时间对精子运动率的影响47-49
• 第四章 太平洋牡蛎精液的超低温保存研究49-61
• 1 材料与方法49-52
• 1.1 太平洋牡蛎的采集49-50
• 1.2 精液活力的检测50
• 1.3 抗冻保护液的配制50
• 1.4 实验设计50-52
• 1.4.1 抗冻保护剂种类对太平洋牡蛎精液冷冻保存的影响50
• 1.4.2 抗冻剂浓度对太平洋牡蛎精液冷冻保存效果的影响50
• 1.4.3 三种稀释液对精液冷冻效果的影响50-51
• 1.4.4 精液与抗冻液稀释比例对太平洋牡蛎精液冷冻保存效果的影响51
• 1.4.5 不同降温程序对精液冷冻保存效果的影响51
• 1.4.6 抗冻添加剂对精液冷冻效果的影响51-52
• 1.4.7 受精率和孵化率的测定52
• 1.4.8 统计分析52
• 2 结果52-57
• 2.1 抗冻剂种类对太平洋牡蛎精液冷冻保存效果的影响52-53
• 2.2 抗冻剂浓度对太平洋牡蛎精液保存效果的影响53-54
• 2.3 稀释液种类对太平洋牡蛎精液保存效果的影响54
• 2.4 不同稀释比例对太平洋牡蛎精液保存效果的影响54-55
• 2.5 不同添加剂对太平洋牡蛎精液保存效果的影响55
• 2.6 不同降温程序对太平洋牡蛎精液保存效果的影响55-56
• 2.7 太平洋牡蛎精液超低温保存对受精率和孵化率的影响56-57
• 3 讨论57-61
• 3.1 不同抗冻剂种类对太平洋牡蛎精液保存效果的影响57
• 3.2 不同抗冻剂浓度对太平洋牡蛎精液保存效果的影响57-58
• 3.3 不同稀释液对太平洋牡蛎精液保存效果的影响58
• 3.4 不同稀释比例对太平洋牡蛎精液保存效果的影响58-59
• 3.5 不同添加剂对太平洋牡蛎精液保存效果的影响59
• 3.6 不同降温速率对太平洋牡蛎精液保存效果的影响59-60
• 3.7 太平洋牡蛎精液超低温冷冻对受精率和孵化率的影响60-61
• 第五章 太平洋牡蛎精子超低温冷冻后超微结构损伤研究61-74
• 1 材料与方法61-63
• 1.1 实验材料62
• 1.2 实验方法62-63
• 1.2.1 精子的超低温冻存及解冻62
• 1.2.2 鲜精与冻精的活力测定62
• 1.2.3 受精率和孵化率的测定62
• 1.2.4 鲜精与冻精的超微结构观察62-63
• 1.3 数据处理63
• 2 结果63-70
• 2.1 太平洋牡蛎鲜精及冻精的受精率、孵化率及运动率63
• 2.2 太平洋牡蛎鲜精及冻精的超微结构63-70
• 2.2.1 太平洋牡蛎精子冷冻前后扫描电镜超微结构63-65
• 2.2.2 太平洋牡蛎精子冷冻前后透射电镜超微结构65-70
• 3 讨论70-72
• 4. 小结72-74
• 第六章 太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温保存研究74-83
• 1. 材料与方法75-76
• 1.1 太平洋牡蛎担轮幼虫的采集75
• 1.2 实验方法75-76
• 1.3 太平洋牡蛎担轮幼虫活力测定76
• 1.4 数据处理76
• 2 结果76-80
• 2.1 不同浓度及种类的抗冻保护剂对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用76-77
• 2.2 抗冻保护剂浓度及种类对太平洋牡蛎担轮幼虫超低温保存的影响77-79
• 2.3 太平洋牡蛎担轮幼虫超低温保存方法的筛选79-80
• 3 讨论80-83
• 3.1 抗冻保护剂种类和浓度对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用80-81
• 3.2 太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温保存81-83
• 参考文献83-95
• 致谢95-96
• 个人简历96-97
• 论文及专利发表情况97-98

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