坦布苏病毒MM1775株反向遗传操作系统的建立及拯救病毒的生物学特性研究
发布时间：2021-08-20 03:42
自2010年鸭坦布苏病毒病在我国首次爆发以来,该病给我国鸭养殖业造成了巨大的经济损失。该病主要表现为产蛋鸭产蛋率骤降,并伴有高热、食欲下降、运动障碍等临床症状,严重时可导致鸭死亡。第一株坦布苏病毒分离株（MM1775株）,是从马来西亚地区的蚊子体内分离到的。在随后几十年陆续从蚊子体内分离到很多株坦布苏病毒,但却很少有动物感染该病毒的报道。到目前为止,早期坦布苏病毒蚊体分离株在不同动物体内的复制能力、对动物的致病性及在动物间的传播能力等生物学特性尚不可知。了解坦布苏病毒早期分离株与我国现在流行的鸭坦布苏病毒株的生物学特性的差异,对研究坦布苏病毒的致病机制具有重要意义。为了比较MM1775和FX2010这两株病毒基因组序列的差异,本研究测定了MM1775完整的基因组序列。通过5’和3’RACE技术扩增得到MM1775基因组5’和3’末端的序列。利用RT-PCR扩增得到10段两两重叠的涵盖MM1775全基因组的目的片段,序列拼接后得到了MM1775全基因组序列。与FX2010的全基因组序列相比,编码蛋白（C、pr M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）依次有...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
’RACE（A）和3’RACE（B）电泳结果
图 2.1 5’RACE（A）和 3’ RACE（B）电泳结果Fig. 2.1 ResμLts of 5’RACE（A） and 3’RACE（B）2.3.2 MM1775 基因组分片段扩增结果在得到 MM1775 基因组 5’末端和 3’末端序列后，以设计的 7 个特异性反转录引物混合后作为特异性反转录引物，以病毒 RNA 为模板，经 SuperScriptⅢ反转录酶将 RNA 反转录为 cDNA，以此 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增、凝胶电泳（图 2.2）、割胶回收等步骤，得到 10 段覆盖全基因组的序列，经拼接后得到 MM1775 全基因组序列。
中国农业科学院硕士学位论文 第二章 坦布苏病毒 MM1775 株全基因组序列测定2.3.3 MM1775 和 FX2010 基因组序列比较利用 5’和 3’RACE 技术得到 MM1775 基因组 5’和 3’末端序列，随后参考 GenBank 中已经发表的 MM1775 开放阅读框序列设计 10 对 PCR 引物，扩增得到 10 段特异性片段，相邻两个片段之间有一部分重叠序列，通过对 10 段 PCR 产物的纯化、测序，并通过 DNAstar 软件中的 SegMan程序拼接得到 MM1775 的全基因序列。此序列的开放阅读框与 GenBank 中已经发表的 MM1775株开放阅读框有五个核苷酸不同，分别为 521(C/T)，1398(C/A)，1948(C/T)，5890(C/T) 和 7499(G/A)（核苷酸在基因组中的位置（本研究所用 MM1775 的核苷酸/已发表的 MM1775 核苷酸））。MM1775 全基因组共包含 11001bp 核苷酸，5’非翻译区由 94 个核苷酸组成，3’非翻译区由 629 个核苷酸组成，其中含有一个大小为 10278bp 的开放阅读框，编码产生大小为 3425 个氨基酸的多聚蛋白，同黄病毒属的其他病毒一样，该多聚蛋白在相关蛋白酶的作用下裂解为 3 个结构蛋白(C，prM，E)和 7 个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和 NS5)。与 FX2010 的蛋白质氨基酸残基相比，不同点分别有：5/12(4.2%)，4/167(2.4%)，16/501(3.2%)，21/352(6.0%)，16/227(7.5%)，4/131(3.1%)，8/619(1.3%)，4/126(3.2%)，5/254(2.0%) 和 18/905(2.0%)（表 2.4）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量PCR方法的优化[J]. 彭珊,闫丽萍,李国新,李雪松,滕巧泱,肖亚莉,何文兴,李泽君. 中国预防兽医学报. 2013(04)
[2]密码子优化对鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗免疫应答的增强作用[J]. 徐大伟,李国新,李雪松,李云章,李泽君. 中国兽医科学. 2012(05)
[3]鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗构建及免疫原性的初步研究[J]. 徐大伟,李国新,李雪松,姬希文,李云章,李泽君. 中国预防兽医学报. 2012(04)
[4]鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达[J]. 姬希文,李雪松,边延峰,李国新,颜丕熙,张七斤,李泽君. 中国动物传染病学报. 2012(02)
[5]鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备[J]. 姬希文,李雪松,李国新,肖亚莉,颜丕熙,徐大伟,范钊,张七斤,李泽君. 中国家禽. 2012(04)
[6]鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 李泽君. 中国家禽. 2011(17)
[7]鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 姬希文,闫丽萍,颜丕熙,李国新,张七斤,李泽君. 中国预防兽医学报. 2011(08)
[8]应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒[J]. 颜丕熙,李国新,吴晓刚,闫丽萍,滕巧泱,李泽君. 中国动物传染病学报. 2011(03)
[9]黄病毒的感染性克隆和嵌合突变体[J]. 范宝昌. 国外医学.病毒学分册. 2003(01)
硕士论文
[1]鸭坦布苏病毒E蛋白抗原性分析[D]. 余磊.中国农业科学院 2014
[2]鸭坦布苏病毒反向遗传操作系统的建立[D]. 石迎.山东农业大学 2014
[3]鸭坦布苏病毒弱毒株反向遗传操作系统的建立[D]. 吴晓刚.中国农业科学院 2014
[4]鸭坦布苏病毒在鸡胚成纤维细胞上的传代致弱研究[D]. 肖亚莉.中国农业科学院 2013
本文编号：3352740
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
’RACE（A）和3’RACE（B）电泳结果
图 2.1 5’RACE（A）和 3’ RACE（B）电泳结果Fig. 2.1 ResμLts of 5’RACE（A） and 3’RACE（B）2.3.2 MM1775 基因组分片段扩增结果在得到 MM1775 基因组 5’末端和 3’末端序列后，以设计的 7 个特异性反转录引物混合后作为特异性反转录引物，以病毒 RNA 为模板，经 SuperScriptⅢ反转录酶将 RNA 反转录为 cDNA，以此 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增、凝胶电泳（图 2.2）、割胶回收等步骤，得到 10 段覆盖全基因组的序列，经拼接后得到 MM1775 全基因组序列。
中国农业科学院硕士学位论文 第二章 坦布苏病毒 MM1775 株全基因组序列测定2.3.3 MM1775 和 FX2010 基因组序列比较利用 5’和 3’RACE 技术得到 MM1775 基因组 5’和 3’末端序列，随后参考 GenBank 中已经发表的 MM1775 开放阅读框序列设计 10 对 PCR 引物，扩增得到 10 段特异性片段，相邻两个片段之间有一部分重叠序列，通过对 10 段 PCR 产物的纯化、测序，并通过 DNAstar 软件中的 SegMan程序拼接得到 MM1775 的全基因序列。此序列的开放阅读框与 GenBank 中已经发表的 MM1775株开放阅读框有五个核苷酸不同，分别为 521(C/T)，1398(C/A)，1948(C/T)，5890(C/T) 和 7499(G/A)（核苷酸在基因组中的位置（本研究所用 MM1775 的核苷酸/已发表的 MM1775 核苷酸））。MM1775 全基因组共包含 11001bp 核苷酸，5’非翻译区由 94 个核苷酸组成，3’非翻译区由 629 个核苷酸组成，其中含有一个大小为 10278bp 的开放阅读框，编码产生大小为 3425 个氨基酸的多聚蛋白，同黄病毒属的其他病毒一样，该多聚蛋白在相关蛋白酶的作用下裂解为 3 个结构蛋白(C，prM，E)和 7 个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和 NS5)。与 FX2010 的蛋白质氨基酸残基相比，不同点分别有：5/12(4.2%)，4/167(2.4%)，16/501(3.2%)，21/352(6.0%)，16/227(7.5%)，4/131(3.1%)，8/619(1.3%)，4/126(3.2%)，5/254(2.0%) 和 18/905(2.0%)（表 2.4）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量PCR方法的优化[J]. 彭珊,闫丽萍,李国新,李雪松,滕巧泱,肖亚莉,何文兴,李泽君. 中国预防兽医学报. 2013(04)
[2]密码子优化对鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗免疫应答的增强作用[J]. 徐大伟,李国新,李雪松,李云章,李泽君. 中国兽医科学. 2012(05)
[3]鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗构建及免疫原性的初步研究[J]. 徐大伟,李国新,李雪松,姬希文,李云章,李泽君. 中国预防兽医学报. 2012(04)
[4]鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达[J]. 姬希文,李雪松,边延峰,李国新,颜丕熙,张七斤,李泽君. 中国动物传染病学报. 2012(02)
[5]鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备[J]. 姬希文,李雪松,李国新,肖亚莉,颜丕熙,徐大伟,范钊,张七斤,李泽君. 中国家禽. 2012(04)
[6]鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 李泽君. 中国家禽. 2011(17)
[7]鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 姬希文,闫丽萍,颜丕熙,李国新,张七斤,李泽君. 中国预防兽医学报. 2011(08)
[8]应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒[J]. 颜丕熙,李国新,吴晓刚,闫丽萍,滕巧泱,李泽君. 中国动物传染病学报. 2011(03)
[9]黄病毒的感染性克隆和嵌合突变体[J]. 范宝昌. 国外医学.病毒学分册. 2003(01)
硕士论文
[1]鸭坦布苏病毒E蛋白抗原性分析[D]. 余磊.中国农业科学院 2014
[2]鸭坦布苏病毒反向遗传操作系统的建立[D]. 石迎.山东农业大学 2014
[3]鸭坦布苏病毒弱毒株反向遗传操作系统的建立[D]. 吴晓刚.中国农业科学院 2014
[4]鸭坦布苏病毒在鸡胚成纤维细胞上的传代致弱研究[D]. 肖亚莉.中国农业科学院 2013
本文编号：3352740
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/zaizhiyanjiusheng/3352740.html
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