菊花CmCLCa基因的表达分析及功能验证
发布时间：2021-08-21 06:28
菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是我国十大传统名花和世界四大鲜切花之一,其栽培面积和产量在各花卉中均居于前列。氮素营养水平通常会影响菊花的产量和品质。硝态氮（NO3--N）是菊花吸收氮素的主要形式。根系吸收的NO3-经过木质部导管长途转运后主要存储在叶片液泡中,并能在氮源不足时将储存在液泡中的N03-释放出来供菊花再分配和再利用。因此,了解N03-在菊花叶片液泡中的储存机制对培育氮高效利用率和氮饥饿耐受性高的菊花新品种至关重要。近年来的研究发现定位于液泡膜上的CLC家族的一些基因可能参与植物液泡N03-的存储。但在菊花中关于这一方面的报道还比较少。本研究以菊花扦插生根苗‘神马’为试材,外源N03-水培条件下筛选出液泡NO3-响应基因CnCLCa并对其进行功能验证。主要研究内容及结果:1、外源NO3-能诱导菊花CmCLCa的表达用含有5 mM KN03的Hoagland营养液水培处理（对照为不含N元素的Hoagland营养液）后,分别在第0、1、4、8、12、16、20和24 h对液泡NO3-存储相关基因CmCLCa-c、CmCLCg进行实时荧光定量...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
外源NO3-处理对菊花叶片液泡NO3-存储相关基因相对表达量的影响
山东农业大学硕士学位论文下同。Fig.3-1EffectsofexogenousNO3-treatmentontherelativeexpressionlevelsofvacuolarNO3-storage-relatedgenesCmCLCa-candCmCLCginchrysanthemumleavesA:CmCLCa;B:CmCLCb;C:CmCLCc;D:CmCLCg.Dataaremean±SE(n=3).DifferentlowercaselettersonbarsindicatestatisticallysignificantdifferencesinmeanvaluesatP<0.05.Thesameasfollows.3.1.2NO3-处理对菊花叶片液泡中NO3-含量的影响在本实验中，我们还测定了外源NO3-（5mMNO3-）处理下菊花叶片液泡内NO3-含量的变化（图3-2）。实验结果表明，随着处理时间的延长，菊花叶片液泡NO3-含量不断增加，并在处理第8h达到最大值为7.4umolNO3-/umolp-nitrophenol，之后虽有所下降但始终保持在较为稳定的状态且明显高于对照。这一变化趋势与外源NO3-处理下菊花CmCLCa基因相对表达量的变化趋势一致（图3-1A）。图3-2外源NO3-处理对菊花叶片液泡NO3-含量的影响Fig.3-2EffectofexogenousNO3-treatmentonthevacuolarNO3-contentofchrysanthemumleaves3.2菊花CmCLCa基因的功能鉴定3.2.1农杆菌介导的菊花遗传转化前面的实验我们发现外源NO3-能够诱导菊花CmCLCa的表达，同时液泡中存储的NO3-含量也显著增加。我们猜测，液泡中存储NO3-含量的增加是否与CmCLCa基因相对表达量升高有关？为了进一步探究CmCLCa基因与液泡中积累NO3-之间的关系，我们通过与拟南芥AtCLCa序列比对获得了384bp的保守区域，然后用于在沉默构建体中生成RNAi片段，并获得了CmCLCa-RNAi转基因菊花‘神马’组培苗（图3-3）。25
菊花CmCLCa基因的表达分析及功能验证图3-3CmCLCa-RNAi转基因‘神马’组培苗比例尺=1cm。Fig.3-3CmCLCa-RNAitransgenic‘Jinba’tissuecultureseedlingsScalebar:1cm.3.2.2CmCLCa-RNAi转基因菊花的分子鉴定在菊花转基因过程中，当分化出的小苗长到约5cm时，取叶片进行分子水平检测（图3-4A，B）。半定量PCR结果显示转基因系#1，#2，#3在384bp左右有单一且比较清晰明亮的条带，#5有拖尾现象，#4无条带。同时，定量PCR排除了转基因系#1，#2，#3为假阳性菊花苗的可能。因此，我们选择转基因菊花系#1、#2、#3用于接下来的实验。图3-4B为其相对表达抑制情况：与WT相比，转基因菊花系#1、#2、#3中CmCLCa的表达量分别下降了25.1%、32.4%、23.3%。图3-4CmCLCa-RNAi转基因菊花的分子检测A：半定量PCR检测；B：q-RTPCR检测Fig.3-4ThemoleculardetectionofCmCLCa-RNAitransgenicchrysanthemumA:semi-quantitativePCRdetection;B:quantitativePCRdetection26
【参考文献】：
期刊论文
[1]氮素形态对烟草生长及品质影响的研究进展[J]. 张杰,黄海棠,杨立均,许自成. 中国农学通报. 2018(15)
[2]菊花基因组DNA甲基化水平对根系硝态氮吸收的影响[J]. 于媛媛,郭芸珲,温立柱,孙翠慧,樊红梅,孙宪芝,王文莉,孙霞,郑成淑. 植物生理学报. 2018(05)
[3]菊花花瓣伸长相关基因CmXTHs的克隆与功能验证[J]. 温立柱,孙霞,任红,樊红梅,于媛媛,郭芸珲,郑成淑. 园艺学报. 2017(11)
[4]硝态氮影响菊花根系形态结构变化的分子基础[J]. 郭芸珲,于媛媛,温立柱,孙翠慧,孙宪芝,王文莉,孙霞,郑成淑. 中国农业科学. 2017(09)
[5]作物硝态氮转运利用与氮素利用效率的关系[J]. 张振华. 植物营养与肥料学报. 2017(01)
[6]玉米ZmCLCa基因克隆及其对氮素吸收的功能验证[J]. 曾廷儒,张静,张登峰,杜金友. 植物遗传资源学报. 2017(01)
[7]植物中氮素利用及硝态氮转运蛋白的研究进展[J]. 胡春吉,雷宁,邹良平,彭明. 分子植物育种. 2016(08)
[8]施用氮肥对油用牡丹叶片氮素吸收积累与籽粒品质的影响[J]. 姜天华,单佩佩,黄在范,温立柱,孙翠慧,刘坤,郑成淑. 应用生态学报. 2016(10)
[9]玉米CLC家族基因差异表达及其与NO3-、Cl-吸收之间的关系[J]. 曾廷儒,张静,刘书晓,杜金友. 玉米科学. 2016(02)
[10]覆草和氮肥对苹果光合作用的影响[J]. 赵慧颖,许彬. 种子世界. 2016(04)
博士论文
[1]MADS-box转录因子CmANR1调控菊花根系发育的机理研究[D]. 孙翠慧.山东农业大学 2018
[2]菊花CmNRTs基因的克隆及功能鉴定[D]. 顾春笋.南京农业大学 2012
硕士论文
[1]盐地碱蓬SsCLC-1在硝态氮累积过程中的功能研究[D]. 段会敏.山东师范大学 2019
[2]水分胁迫下施加硝态氮对葡萄幼苗氮素代谢及相关酶的影响[D]. 杨夕.石河子大学 2018
[3]菊花基因组DNA甲基化水平对根系硝态氮吸收的影响[D]. 于媛媛.山东农业大学 2018
[4]菊花根系响应硝态氮的形态结构和分子基础[D]. 郭芸珲.山东农业大学 2018
[5]玉米CLC基因家族的表达分析及ZmCLCa基因的功能验证[D]. 曾廷儒.河北科技师范学院 2016
[6]拟南芥氯离子通道蛋白CLC-c在生长和盐胁迫中的作用及其在油菜中超表达[D]. 覃海英.华中农业大学 2013
[7]不同生境盐地碱蓬对低浓度硝态氮的响应[D]. 张晓东.山东师范大学 2013
[8]油菜氮高效种质的筛选及高效机制[D]. 田飞.华中农业大学 2011
[9]氮营养对切花菊‘优香’品质影响研究[D]. 杨迎东.中国农业科学院 2010
[10]切花菊‘神马’氮营养研究[D]. 孙凯.北京林业大学 2007
本文编号：3355066
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
外源NO3-处理对菊花叶片液泡NO3-存储相关基因相对表达量的影响
山东农业大学硕士学位论文下同。Fig.3-1EffectsofexogenousNO3-treatmentontherelativeexpressionlevelsofvacuolarNO3-storage-relatedgenesCmCLCa-candCmCLCginchrysanthemumleavesA:CmCLCa;B:CmCLCb;C:CmCLCc;D:CmCLCg.Dataaremean±SE(n=3).DifferentlowercaselettersonbarsindicatestatisticallysignificantdifferencesinmeanvaluesatP<0.05.Thesameasfollows.3.1.2NO3-处理对菊花叶片液泡中NO3-含量的影响在本实验中，我们还测定了外源NO3-（5mMNO3-）处理下菊花叶片液泡内NO3-含量的变化（图3-2）。实验结果表明，随着处理时间的延长，菊花叶片液泡NO3-含量不断增加，并在处理第8h达到最大值为7.4umolNO3-/umolp-nitrophenol，之后虽有所下降但始终保持在较为稳定的状态且明显高于对照。这一变化趋势与外源NO3-处理下菊花CmCLCa基因相对表达量的变化趋势一致（图3-1A）。图3-2外源NO3-处理对菊花叶片液泡NO3-含量的影响Fig.3-2EffectofexogenousNO3-treatmentonthevacuolarNO3-contentofchrysanthemumleaves3.2菊花CmCLCa基因的功能鉴定3.2.1农杆菌介导的菊花遗传转化前面的实验我们发现外源NO3-能够诱导菊花CmCLCa的表达，同时液泡中存储的NO3-含量也显著增加。我们猜测，液泡中存储NO3-含量的增加是否与CmCLCa基因相对表达量升高有关？为了进一步探究CmCLCa基因与液泡中积累NO3-之间的关系，我们通过与拟南芥AtCLCa序列比对获得了384bp的保守区域，然后用于在沉默构建体中生成RNAi片段，并获得了CmCLCa-RNAi转基因菊花‘神马’组培苗（图3-3）。25
菊花CmCLCa基因的表达分析及功能验证图3-3CmCLCa-RNAi转基因‘神马’组培苗比例尺=1cm。Fig.3-3CmCLCa-RNAitransgenic‘Jinba’tissuecultureseedlingsScalebar:1cm.3.2.2CmCLCa-RNAi转基因菊花的分子鉴定在菊花转基因过程中，当分化出的小苗长到约5cm时，取叶片进行分子水平检测（图3-4A，B）。半定量PCR结果显示转基因系#1，#2，#3在384bp左右有单一且比较清晰明亮的条带，#5有拖尾现象，#4无条带。同时，定量PCR排除了转基因系#1，#2，#3为假阳性菊花苗的可能。因此，我们选择转基因菊花系#1、#2、#3用于接下来的实验。图3-4B为其相对表达抑制情况：与WT相比，转基因菊花系#1、#2、#3中CmCLCa的表达量分别下降了25.1%、32.4%、23.3%。图3-4CmCLCa-RNAi转基因菊花的分子检测A：半定量PCR检测；B：q-RTPCR检测Fig.3-4ThemoleculardetectionofCmCLCa-RNAitransgenicchrysanthemumA:semi-quantitativePCRdetection;B:quantitativePCRdetection26
【参考文献】：
期刊论文
[1]氮素形态对烟草生长及品质影响的研究进展[J]. 张杰,黄海棠,杨立均,许自成. 中国农学通报. 2018(15)
[2]菊花基因组DNA甲基化水平对根系硝态氮吸收的影响[J]. 于媛媛,郭芸珲,温立柱,孙翠慧,樊红梅,孙宪芝,王文莉,孙霞,郑成淑. 植物生理学报. 2018(05)
[3]菊花花瓣伸长相关基因CmXTHs的克隆与功能验证[J]. 温立柱,孙霞,任红,樊红梅,于媛媛,郭芸珲,郑成淑. 园艺学报. 2017(11)
[4]硝态氮影响菊花根系形态结构变化的分子基础[J]. 郭芸珲,于媛媛,温立柱,孙翠慧,孙宪芝,王文莉,孙霞,郑成淑. 中国农业科学. 2017(09)
[5]作物硝态氮转运利用与氮素利用效率的关系[J]. 张振华. 植物营养与肥料学报. 2017(01)
[6]玉米ZmCLCa基因克隆及其对氮素吸收的功能验证[J]. 曾廷儒,张静,张登峰,杜金友. 植物遗传资源学报. 2017(01)
[7]植物中氮素利用及硝态氮转运蛋白的研究进展[J]. 胡春吉,雷宁,邹良平,彭明. 分子植物育种. 2016(08)
[8]施用氮肥对油用牡丹叶片氮素吸收积累与籽粒品质的影响[J]. 姜天华,单佩佩,黄在范,温立柱,孙翠慧,刘坤,郑成淑. 应用生态学报. 2016(10)
[9]玉米CLC家族基因差异表达及其与NO3-、Cl-吸收之间的关系[J]. 曾廷儒,张静,刘书晓,杜金友. 玉米科学. 2016(02)
[10]覆草和氮肥对苹果光合作用的影响[J]. 赵慧颖,许彬. 种子世界. 2016(04)
博士论文
[1]MADS-box转录因子CmANR1调控菊花根系发育的机理研究[D]. 孙翠慧.山东农业大学 2018
[2]菊花CmNRTs基因的克隆及功能鉴定[D]. 顾春笋.南京农业大学 2012
硕士论文
[1]盐地碱蓬SsCLC-1在硝态氮累积过程中的功能研究[D]. 段会敏.山东师范大学 2019
[2]水分胁迫下施加硝态氮对葡萄幼苗氮素代谢及相关酶的影响[D]. 杨夕.石河子大学 2018
[3]菊花基因组DNA甲基化水平对根系硝态氮吸收的影响[D]. 于媛媛.山东农业大学 2018
[4]菊花根系响应硝态氮的形态结构和分子基础[D]. 郭芸珲.山东农业大学 2018
[5]玉米CLC基因家族的表达分析及ZmCLCa基因的功能验证[D]. 曾廷儒.河北科技师范学院 2016
[6]拟南芥氯离子通道蛋白CLC-c在生长和盐胁迫中的作用及其在油菜中超表达[D]. 覃海英.华中农业大学 2013
[7]不同生境盐地碱蓬对低浓度硝态氮的响应[D]. 张晓东.山东师范大学 2013
[8]油菜氮高效种质的筛选及高效机制[D]. 田飞.华中农业大学 2011
[9]氮营养对切花菊‘优香’品质影响研究[D]. 杨迎东.中国农业科学院 2010
[10]切花菊‘神马’氮营养研究[D]. 孙凯.北京林业大学 2007
本文编号：3355066
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