3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达

发布时间：2017-05-02 13:08

  本文关键词：3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是菊酯类农药生物降解途径中的第一个代谢产物。3-PBA的半衰期较菊酯类农药更长(180d),生物毒性更大,研究证实3-PBA具有抗雌激素的特性,可紊乱生物体内分泌代谢。因此开展3-PBA的生物降解研究,克隆降解基因,对保障生态安全有重要意义。本研究以实验室分离的菊酯农药降解菌株4-D为出发材料,构建4-D菌基因组文库,以3-PBA为唯一碳源的无机盐平板为筛选平板,通过混合池驯化筛选获得可以3-PBA作唯一碳源的重组菌4D-3-4,通过测序比对并分析插入片段,经ORF分析得到921 bp的完整阅读框,该核苷酸序列命名为D34(Genebank登录号为KR024742),经过Blast比对和生物软件分析,其应为邻苯二酚双加氧酶,是4-D菌降解3-PBA过程中起主要作用的基因。运用Swiss-Model对该基因编码产物进行了氨基酸结构分析和三级结构预测。氨基酸序列长度为306 aa,Aligned蛋白数量为47,PDB结合结构数量为13,该蛋白不含二硫键,具有两个结构域,酶活位点位于第一结构域,第二结构域与蛋白折叠和跨膜相关,其正确折叠需要Ca 2+参与。根据D34完整阅读框序列设计引物,并在引物两端分别加上Nde I和HindⅢ识别位点,以原始菌株基因组DNA为模版,成功克隆到921bp的D34基因序列。以pET-21b为载体,BL21(DE3)为宿主菌,构建了D34基因的非融合原核表达载体,并进行了诱导表达。对重组表达菌株进行了3-PBA的降解性能研究,对表达产物进行了SDS-PAGE验证分析和酶部分理化性质分析。IPTG诱导后可见46kDa大小的蛋白特异表达,表达产物具有邻苯二酚特征反应活性,降解最适条件为pH 7.0,温度30oC,与4-D菌最适生长条件一致。
【关键词】：3-PBA 基因组文库 3-PBA-降解基因 邻苯二酚双加氧酶 原核表达
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S481;Q78
【目录】：

• 附件3-6
• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-22
• 1.1 3-PBA研究进展13-15
• 1.1.1 3-苯氧基苯甲酸概况13
• 1.1.2 3-苯氧基苯甲酸相关的微生物代谢研究13-14
• 1.1.3 微生物降解 3-苯氧基苯甲酸的途径14-15
• 1.2 常规检测 3-PBA方法15-16
• 1.2.1 HPLC法测定土壤中 3-PBA浓度15-16
• 1.2.2 气质联用检测尿液中 3-PBA残留浓度16
• 1.2.3 HPLC法测定微生物培养体系中 3-PBA16
• 1.2.4 结合分散液-液微萃取和注射.硅烷基化及MIP的新方法16
• 1.3 基因组文库技术应用16-18
• 1.3.1 基因组文库简介16-18
• 1.3.2 基因组文库应用18
• 1.4 原核表达研究概况18-19
• 1.5 本研究背景、意义与技术路线19-22
• 1.5.1 研究背景、意义与创新点19-21
• 1.5.2 技术路线图21-22
• 第二章 HPLC法检测不动杆菌对 3-PBA降解能力22-27
• 2.1 材料与试剂22-23
• 2.1.1 材料22
• 2.1.2 实验仪器22
• 2.1.3 化学试剂22-23
• 2.2 实验方法23-24
• 2.2.1 4-D菌的活化与降解驯化23
• 2.2.2 HPLC检测 4-D降解体系中的 3-PBA浓度23
• 2.2.3 3-苯氧基苯甲酸标准曲线的绘制23
• 2.2.4 绘制3-PBA降解曲线23-24
• 2.3 实验结果与分析24-25
• 2.3.1 3-PBA检测方法确定24
• 2.3.2 3-PBA标准曲线24-25
• 2.3.3 4-D菌、大肠杆菌JM109及转化载体pUC19的JM109对 3-PBA的降解情况25
• 2.4 讨论25-27
• 第三章 构建不动杆菌（Acinetobactersp.）基因组文库27-33
• 3.1 材料与试剂27-28
• 3.1.1 材料27
• 3.1.2 实验仪器27
• 3.1.3 化学试剂27-28
• 3.2 试验方法28-30
• 3.2.1 基因组DNA提取28
• 3.2.2 质粒DNA提取28
• 3.2.3 基因组DNA部分酶切体系28-29
• 3.2.4 载体DNA完全酶切体系及 5’磷酸基团去磷酸化处理29
• 3.2.5 连接体系29
• 3.2.6 感受态细胞制备29-30
• 3.2.7 转化30
• 3.2.8 基因组文库验证30
• 3.3 实验结果30-31
• 3.3.1 基因组DNA与质粒DNA提取和酶切验证30-31
• 3.3.2 目的片段与载体的连接转化及文库随机验证31
• 3.4 讨论31-33
• 第四章 文库池筛获得 3-PBA降解重组子33-41
• 4.1 材料与试剂33
• 4.1.1 实验材料33
• 4.1.2 实验仪器33
• 4.1.3 试剂33
• 4.2 实验方法33-34
• 4.2.1 阳性克隆筛选33-34
• 4.2.2 混合池构建及驯化筛选34
• 4.2.3 序列验证、测序与ORF分析34
• 4.2.4 氨基酸结构预测与分析34
• 4.3 实验结果34-40
• 4.3.1 阳性重组载体验证34-35
• 4.3.2 ORF比对35-36
• 4.3.3 921 bp ORF序列信息36-37
• 4.3.4 Blast比对结果37
• 4.3.5 氨基酸序列分析及三级结构预测37-40
• 4.4 实验讨论40-41
• 第五章 3-PBA降解关键基因克隆与表达载体构建41-52
• 5.1 实验材料41-42
• 5.1.1 菌株与质粒41
• 5.1.2 主要仪器41
• 5.1.3 主要试剂41-42
• 5.1.4 主要试剂配制42
• 5.2 实验方法42-46
• 5.2.1 实验路线42-43
• 5.2.2 pET-21b-D34表达载体的构建43-45
• 5.2.3 重组表达载体工程菌的诱导表达45-46
• 5.2.4 重组表达载体工程菌的降解验证46
• 5.3 结果与分析46-51
• 5.3.1 目的基因的获得46
• 5.3.2 D34与T载体的连接转化与阳性重组双酶切验证46-48
• 5.3.3 D34与pET-21b载体的连接与重组载体验证48-49
• 5.3.4 SDS-PAGE分析工程菌的诱导表达49-50
• 5.3.5 芳香族底物反应实验50
• 5.3.6 重组表达菌降解验证50-51
• 5.3.7 降解酶最适条件优化51
• 5.4 讨论51-52
• 第六章 全文结论与展望52-53
• 6.1 全文结论52
• 6.2 展望52-53
• 参考文献53-59
• 附录59-64
• 致谢64-65
• 作者简历65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 虞云龙,陈鹤鑫,樊德方,盛国英,傅家谟;拟除虫菊酯类杀虫剂的酶促降解[J];环境科学;1998年03期

2 王兆守;李顺鹏;;拟除虫菊酯类农药微生物降解研究进展[J];土壤;2005年06期

3 ;Immunization of Male Mice with a New Recombinant GnRH Fusion Protein Reduces the Testicular Function[J];Agricultural Sciences in China;2009年03期

4 余慧群;廖艳芳;周海;莫友彬;黄科林;林卫江;慕朝师;;拟除虫菊酯杀虫剂研究进展[J];企业科技与发展;2010年20期

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