大兴安岭野生蓝莓菌根真菌分离及定殖分析

发布时间：2017-05-03 03:02

  本文关键词：大兴安岭野生蓝莓菌根真菌分离及定殖分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：与自然界中绝大多数植物相似,蓝莓的根系中也存在着菌根真菌共生,这类菌根属杜鹃花类菌根(Ericoid mycorrhizal, ERM)。菌根对蓝莓植株的营养吸收、抗病性、抗逆性有很大的改善作用,其生物学促生功能极为重要。本研究对大兴安岭地区野生蓝莓菌根真菌进行了分离、鉴定,并利用原位PCR技术分析菌根真菌在蓝莓植株根系的定殖情况。通过对大兴安岭地区野生蓝莓菌根真菌主要类群及其定殖情况的了解,可以为优良菌剂的开发应用奠定基础,促进大兴安岭地区野生蓝莓引种栽培及繁育,同时也对菌根技术在农业生产上的应用具有重要的意义。结果如下：(1)以大兴安岭野生蓝莓须根为实验材料,利用马丁—孟加拉红(MA)培养基、MMN培养基分离了139株真菌,经菌落形态结合分子生物学方法鉴定后分类结果如下：Oidiodendron、Crypyosporiopsis、Phialocephale、Lachnum、Yarrowia lipolytica、 Chaetomium globosum、Sordariomycetes sp.、Mucoromycotina sp.。(2)以质粒pCAMBIA1300为骨架,将质粒pCT74上的增强型GFP表达盒克隆到该质粒的多克隆位点区(multiple cloning site, MCS),将质粒pCT74上的真菌潮霉素抗性基因(hygromycin resisitant gene, HYG)表达盒克隆替换pCAMBIA1300原有的HYG表达盒,成功构建了表达载体pXBtCEH-GFP。(3)利用根癌农杆菌介导法(agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)成功使GFP基因在两种蓝莓内生真菌Crypyosporiopsis ericae、Sordariomycetessp.的菌丝体内表达,通过荧光显微镜成功观察到了荧光菌丝形态,转化子经五代培养后荧光活性稳定,通过PCR成功从转化子基因组中得到GFP标记片段。(4)以经菌根真菌回接处理的蓝莓组培无菌苗为实验材料,制作根系的横切与纵切冰冻切片,以ITS1/ITS4引物,以菌根真菌18S核糖体rDNA为模板,成功合成地高辛标记的特异性DNA探针,通过原位PCR方法对真菌在蓝莓根部的定殖做出初步分析。结果显示,供试菌根真菌均有效的在蓝莓根系内定殖,定殖分布主要集中于根系的表皮和靠近表皮的皮层薄壁细胞间隙中,菌根真菌菌丝在根表有多个侵入点,表皮部位的定殖数量大于皮层中的数量。
【关键词】：菌根真菌 绿色荧光蛋白 原位PCR 定殖
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S663.9;Q93
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 绪论9-15
• 1.1 引言9
• 1.2 蓝莓9
• 1.3 植物菌根真菌的研究概况9-12
• 1.3.1 菌根9-10
• 1.3.2 菌根的分类及特征10
• 1.3.3 菌根的生物学作用10-11
• 1.3.4 菌根真菌及其物种多样性11
• 1.3.5 菌根真菌的定殖11-12
• 1.3.6 影响菌根真菌的定殖的因素12
• 1.4 绿色荧光蛋白在真菌中的应用研究12-13
• 1.4.1 绿色荧光蛋白12
• 1.4.2 绿色荧光蛋白作为标记物的优点12-13
• 1.4.3 GFP标记微生物在植物体内定殖的研究13
• 1.5 地高辛标记原位杂交的原理及应用13-14
• 1.5.1 地高辛标记原位杂交的原理13
• 1.5.2 地高辛标记原位杂交的应用13-14
• 1.6 本研究的目的意义14-15
• 2 大兴安岭蓝莓菌根真菌分离鉴定15-24
• 2.1 实验材料15-16
• 2.1.1 蓝莓菌根材料及采集地情况15
• 2.1.2 培养基15
• 2.1.3 其他试剂15-16
• 2.1.4 主要仪器设备16
• 2.2 实验方法16-18
• 2.2.1 菌根真菌的分离16
• 2.2.2 菌根真菌初步分类16-17
• 2.2.3 CTAB法提取菌根真菌基因组DNA17
• 2.2.4 PCR获得菌根真菌基因组ITS段17-18
• 2.2.5 PCR产物的测序及序列分析18
• 2.3 结果与分析18-22
• 2.3.1 蓝莓菌根真菌的分离18-19
• 2.3.2 菌根真菌的分子生物学鉴定19-22
• 2.4 讨论22-23
• 2.5 本章小结23-24
• 3 农杆菌介导菌根真菌GFP标记遗传转化24-39
• 3.1 实验材料24-25
• 3.1.1 菌株24
• 3.1.2 质粒24-25
• 3.2 仪器和试剂25-27
• 3.2.1 主要仪器25
• 3.2.2 试剂和培养基25-27
• 3.3 方法27-32
• 3.3.1 GFP表达盒的扩增27
• 3.3.2 GFP表达盒的克隆鉴定27-28
• 3.3.3 质粒pCAMBIA1300的双酶切28
• 3.3.4 重组质粒pCEH-GFP的获得与酶切鉴定28
• 3.3.5 HYG表达盒的酶切与测序鉴定28-29
• 3.3.6 表达载体pXBtCEH-GFP的构建29-30
• 3.3.7 菌根真菌潮霉素抗性的检测30
• 3.3.8 农杆菌的电击转化30-31
• 3.3.9 根癌农杆菌介导遗传转化31-32
• 3.4 结果与分析32-38
• 3.4.1 GFP表达原件的扩增32
• 3.4.2 pEASY-GFP的构建及验证32-33
• 3.4.3 pCEH-GFP的构建及验证33
• 3.4.4 HYG表达盒的酶切及测序验证33-34
• 3.4.5 pXBtCEH-GFP的构建及验证34
• 3.4.6 hygB对菌根真菌生长的影响34-35
• 3.4.7 农杆菌转化子验证35
• 3.4.8 菌根真菌转化子获得及菌丝荧光观察35
• 3.4.9 菌根真菌转化子验证35-38
• 3.5 讨论38
• 3.6 本章小结38-39
• 4 蓝莓菌根真菌定殖情况初探39-47
• 4.1 材料和仪器试剂39
• 4.1.1 实验材料39
• 4.1.2 实验试剂39
• 4.2 实验方法39-42
• 4.2.1 菌根真菌侵染蓝莓无菌组培苗39-40
• 4.2.2 PCR法制备地高辛标记探针40
• 4.2.3 斑点杂交验证探针有效性40-41
• 4.2.4 蓝莓菌根冰冻切片的制作41
• 4.2.5 冰冻切片的固定41
• 4.2.6 冰冻切片的消化41
• 4.2.7 原位PCR放大信号41-42
• 4.2.8 杂交42
• 4.3 结果与分析42-46
• 4.3.1 探针制备42
• 4.3.2 斑点杂交验证探针有效性42-43
• 4.3.3 蓝莓须根组织冰冻切片的杂交结果43-46
• 4.4 讨论46
• 4.5 本章小结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 攻读学位期间发表的学术论文52-53
• 致谢53-54

【参考文献】

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