旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的抗原性和对树突状细胞的免疫调节性研究
发布时间：2021-10-29 11:46
旋毛虫（Trichinella spiralis）是一种典型的人兽共患寄生线虫,其引发的旋毛虫病是一种世界广泛分布的食源性寄生虫病。目前的诊断方法主要为集样消化法和ELISA检测方法。肌幼虫排泄分泌产物（ES）为应用最广泛的诊断抗原,但具有期特异性且成分复杂。旋毛虫相关蛋白可引发宿主Th2型免疫反应,造成宿主的免疫抑制,进而形成慢性感染导致长期寄生,现阶段该反应机理尚不清楚。旋毛虫ES成分复杂,包含多种蛋白酶:丝氨酸蛋白酶、谷胱甘肽转移酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。因此,旋毛虫ES相关抗原分子的分离、鉴定及其抗原性和免疫调节性的研究对于旋毛虫病免疫学检测方法的建立及疫苗研制非常重要。本实验室前期构建了旋毛虫3日龄成虫的c DNA文库,经过免疫学方法筛选得到高丰度与强免疫反应性的丝氨酸蛋白酶基因Ts-Sp-7（Gen Bank登录号EU263332.1）。本研究基于该基因对Ts-Sp-7蛋白抗原性及免疫调节性进行研究。参照Gen Bank公布的Ts-Sp-7基因序列,设计特异性引物,收取感染3天的旋毛虫成虫阶段的总RNA,反转录获取目的序列,常规PCR扩增,并构建原核...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Ts-Sp-7蛋白信号肽预测
第二篇第1章旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达与纯化25图1.3重组质粒pET-28a(+)-Ts-Sp-7的双酶切鉴定Figure1.3DoubleenzymedigestionidentificationofthepET-28a(+)-Ts-Sp-7M.DNA分子质量标准;1.重组质粒的双酶切产物1.3.2目的基因的扩增提取总RNA后进行反转录获得cDNA，作为模板进行目的基因的扩增。目的基因理论大小为1372bp，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物和目的条带大小相对应（图1.2）。虽然存在非特异性条带，但有间隔且含量较低，对之后的PCR产物回收不会有直接影响。测序结果也显示该目的条带序列正确。1.3.3重组质粒双酶切鉴定按照产物回收试剂盒操作步骤对扩增片段进行胶回收，之后酶切连接pET28a空载体，对重组的克隆载体进行双酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳结果可以看出，酶切片段大小与扩增产物大小相符（图1.3），测序证实序列正确，因此，目的基因克隆载体构建成功。图1.2Ts-Sp-7基因PCR扩增Figure1.2PCRamplificationofTs-Sp-7geneM.DNAMarker；1.Ts-Sp-7基因的PCR产物
第二篇第1章旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达与纯化261.3.4重组Ts-Sp-7蛋白的可溶性分析将验证正确的重组质粒pET28a-Ts-Sp-7转化至BL21（DE3）感受态细胞，并对其诱导表达，通过超声破碎菌体，离心后分别取上清与包涵体沉淀进行可溶性分析，pET28a空载体诱导产物做对照。Ts-Sp-7蛋白理论分子量为47.5kDa，由SDS-PAGE结果可以看出，重组Ts-Sp-7蛋白作为包涵体进行表达，且大小与理论分子质量切合（图1.4），6h时表达量达到最高（图1.5）。图1.5目的蛋白的诱导表达Figure1.5TheinducedexpressionofthetargetproteinM.蛋白分子质量标准；1.诱导前2-7.诱导1-6h图1.4目的蛋白可溶性分析Figure1.4SDS-PAGEanalysisofexpressedproteinM.蛋白质分子质量标准；1.pET-28a(+)空载体的诱导产物；2.pET-28a(+)-Ts-Sp-7诱导后超声上清；3.pET-28a(+)-Ts-Sp-7诱导后超声沉淀
【参考文献】：
期刊论文
[1]旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 张胜兰,刘琰,李岩松,刘晓雷,白雪,唐斌,王学林,刘明远,周玉. 中国兽医科学. 2019(11)
[2]上转发光免疫层析技术快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体方法的建立[J]. 王春,张平平,赵勇,唐斌,刘晓雷,白雪,李仕存,刘明远,王学林. 中国兽医学报. 2019(05)
[3]旋毛虫重组蛋白谷胱甘肽S-转移酶对小鼠骨髓源树突状细胞成熟和活化的影响[J]. 索佳文,刘蕾,徐凝,刘晓雷,刘明远,白雪. 中国兽医学报. 2018(03)
[4]家畜旋毛虫病的流行和诊治[J]. 徐丹丹,任春城,程松侠. 现代畜牧科技. 2017(10)
[5]旋毛虫病诊断方法研究综述[J]. 翟铖铖,陈家旭,陈韶红,吴秀萍. 中国动物检疫. 2017(06)
[6]猪旋毛虫病的检疫及无害化处理[J]. 刘春敏. 现代畜牧科技. 2017(06)
[7]人兽共患旋毛虫病的血清流行病学调查[J]. 张有庆,仲海军,蒋玉军. 中国畜牧兽医文摘. 2016(01)
[8]猪旋毛虫病的检疫检验和防控[J]. 王秀梅. 畜牧兽医科技信息. 2015(07)
[9]旋毛虫病免疫诊断抗原的研究进展[J]. 简莎娜,艾琳,陈韶红,蔡玉春,卢艳,陈木新,吴秀萍,田利光,陈家旭. 中国病原生物学杂志. 2015(04)
[10]中国旋毛虫病流行病学和血清学研究概况[J]. 欧阳兆克,郭传坤. 中国热带医学. 2015(04)
博士论文
[1]旋毛虫感染对树突状细胞分化成熟的影响及其免疫机制研究[D]. 姜晶.吉林农业大学 2015
[2]WN10蛋白生物学功能的研究及旋毛虫病免疫学检测方法的建立[D]. 唐斌.吉林大学 2015
[3]旋毛虫不同发育时期抗原基因的筛选与鉴定[D]. 吴秀萍.吉林大学 2009
硕士论文
[1]上转发光免疫层析试纸条快速检测猪旋毛虫方法建立[D]. 王春.吉林大学 2019
[2]旋毛虫组织蛋白酶B的克隆表达及在幼虫侵入小鼠肠上皮细胞中的作用[D]. 韩月.郑州大学 2019
[3]旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶对巨噬细胞和树突状细胞的免疫调节研究[D]. 索佳文.吉林大学 2018
[4]旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶对宿主免疫细胞影响的初步研究[D]. 于建立.吉林大学 2012
[5]旋毛虫、伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库的构建及其免疫学筛选[D]. 杨志东.吉林大学 2007
本文编号：3464591
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Ts-Sp-7蛋白信号肽预测
第二篇第1章旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达与纯化25图1.3重组质粒pET-28a(+)-Ts-Sp-7的双酶切鉴定Figure1.3DoubleenzymedigestionidentificationofthepET-28a(+)-Ts-Sp-7M.DNA分子质量标准;1.重组质粒的双酶切产物1.3.2目的基因的扩增提取总RNA后进行反转录获得cDNA，作为模板进行目的基因的扩增。目的基因理论大小为1372bp，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物和目的条带大小相对应（图1.2）。虽然存在非特异性条带，但有间隔且含量较低，对之后的PCR产物回收不会有直接影响。测序结果也显示该目的条带序列正确。1.3.3重组质粒双酶切鉴定按照产物回收试剂盒操作步骤对扩增片段进行胶回收，之后酶切连接pET28a空载体，对重组的克隆载体进行双酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳结果可以看出，酶切片段大小与扩增产物大小相符（图1.3），测序证实序列正确，因此，目的基因克隆载体构建成功。图1.2Ts-Sp-7基因PCR扩增Figure1.2PCRamplificationofTs-Sp-7geneM.DNAMarker；1.Ts-Sp-7基因的PCR产物
第二篇第1章旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达与纯化261.3.4重组Ts-Sp-7蛋白的可溶性分析将验证正确的重组质粒pET28a-Ts-Sp-7转化至BL21（DE3）感受态细胞，并对其诱导表达，通过超声破碎菌体，离心后分别取上清与包涵体沉淀进行可溶性分析，pET28a空载体诱导产物做对照。Ts-Sp-7蛋白理论分子量为47.5kDa，由SDS-PAGE结果可以看出，重组Ts-Sp-7蛋白作为包涵体进行表达，且大小与理论分子质量切合（图1.4），6h时表达量达到最高（图1.5）。图1.5目的蛋白的诱导表达Figure1.5TheinducedexpressionofthetargetproteinM.蛋白分子质量标准；1.诱导前2-7.诱导1-6h图1.4目的蛋白可溶性分析Figure1.4SDS-PAGEanalysisofexpressedproteinM.蛋白质分子质量标准；1.pET-28a(+)空载体的诱导产物；2.pET-28a(+)-Ts-Sp-7诱导后超声上清；3.pET-28a(+)-Ts-Sp-7诱导后超声沉淀
【参考文献】：
期刊论文
[1]旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 张胜兰,刘琰,李岩松,刘晓雷,白雪,唐斌,王学林,刘明远,周玉. 中国兽医科学. 2019(11)
[2]上转发光免疫层析技术快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体方法的建立[J]. 王春,张平平,赵勇,唐斌,刘晓雷,白雪,李仕存,刘明远,王学林. 中国兽医学报. 2019(05)
[3]旋毛虫重组蛋白谷胱甘肽S-转移酶对小鼠骨髓源树突状细胞成熟和活化的影响[J]. 索佳文,刘蕾,徐凝,刘晓雷,刘明远,白雪. 中国兽医学报. 2018(03)
[4]家畜旋毛虫病的流行和诊治[J]. 徐丹丹,任春城,程松侠. 现代畜牧科技. 2017(10)
[5]旋毛虫病诊断方法研究综述[J]. 翟铖铖,陈家旭,陈韶红,吴秀萍. 中国动物检疫. 2017(06)
[6]猪旋毛虫病的检疫及无害化处理[J]. 刘春敏. 现代畜牧科技. 2017(06)
[7]人兽共患旋毛虫病的血清流行病学调查[J]. 张有庆,仲海军,蒋玉军. 中国畜牧兽医文摘. 2016(01)
[8]猪旋毛虫病的检疫检验和防控[J]. 王秀梅. 畜牧兽医科技信息. 2015(07)
[9]旋毛虫病免疫诊断抗原的研究进展[J]. 简莎娜,艾琳,陈韶红,蔡玉春,卢艳,陈木新,吴秀萍,田利光,陈家旭. 中国病原生物学杂志. 2015(04)
[10]中国旋毛虫病流行病学和血清学研究概况[J]. 欧阳兆克,郭传坤. 中国热带医学. 2015(04)
博士论文
[1]旋毛虫感染对树突状细胞分化成熟的影响及其免疫机制研究[D]. 姜晶.吉林农业大学 2015
[2]WN10蛋白生物学功能的研究及旋毛虫病免疫学检测方法的建立[D]. 唐斌.吉林大学 2015
[3]旋毛虫不同发育时期抗原基因的筛选与鉴定[D]. 吴秀萍.吉林大学 2009
硕士论文
[1]上转发光免疫层析试纸条快速检测猪旋毛虫方法建立[D]. 王春.吉林大学 2019
[2]旋毛虫组织蛋白酶B的克隆表达及在幼虫侵入小鼠肠上皮细胞中的作用[D]. 韩月.郑州大学 2019
[3]旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶对巨噬细胞和树突状细胞的免疫调节研究[D]. 索佳文.吉林大学 2018
[4]旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶对宿主免疫细胞影响的初步研究[D]. 于建立.吉林大学 2012
[5]旋毛虫、伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库的构建及其免疫学筛选[D]. 杨志东.吉林大学 2007
本文编号：3464591
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