猪GSK3β蛋白对IL-10、IL-12和GYS1基因表达的调控研究

发布时间：2017-05-07 08:05

  本文关键词：猪GSK3β蛋白对IL-10、IL-12和GYS1基因表达的调控研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：糖原合成酶激酶3(GSK3)是一种广泛存在于哺乳动物中的丝氨酸／苏氨酸类激酶,其作用的底物高达100多种,参与众多的信号通路并在其中发挥重要的功能。在哺乳动物中GSK3存在GSK3a和GSK3β两种亚型,它们虽然在结构上具有非常高的同源性,但是其功能却是不尽相同的。本研究目的在于探究猪GSK3β蛋白及其不同亚型在炎症反应的作用以及对其直接作用底物糖原合成酶(GS)的转录调控研究,为进一步研究GSK3β基因在猪的抗病育种以及肌肉糖原代谢中的作用提供一定的理论基础。主要结果如下：(1)用LPS诱导猪肾细胞系(PK-15),使其产生炎症反应,或用GSK3β抑制剂LiCl处理细胞,利用Western blot检测GSK3β的磷酸化程度,进而检测其活性变化。结果表明：LPS处理、LiCl处理以及LiCl/LPS共同处理能通过升高PK-15细胞中的GSK3β (ser9)的磷酸化程度从而降低其GSK3β蛋白的活性；(2)利用ELISA技术检测LPS刺激细胞以及先用LiCl处理再用LPS诱导细胞后的细胞培养液中的IL-10和IL-12含量。结果表明：LPS处理极显著增加细胞分泌到培养液中的IL-10和IL-12量(P0.01);而使用GSK3β舌性抑制剂即LiCl预先处理细胞后再用LPS诱导细胞组的IL-10和IL-12表达量较空白组有显著的增加(P0.05),但较LPS处理组又有显著的降低(P0.05),表明GSK3β参与了由LPS诱导的PK-15细胞对IL-10和IL-12的分泌；(3)利用qPCR检测LPS诱导后GSK3β的5种亚型的mRNA的相对表达量。结果发现LPS处理细胞能引起GSK3β基因5种亚型mRNA表达水平的变化。其中GSK3β2在15,30,60和120 min呈现显著地下降(P0.01)；(GSK3β5在30,60和120 mmin呈现显著地下降(P0.05)；GSK3β3在15,30 min有一个短暂的显著上升(P0.05)。这个结果说明,GSK3P基因5种亚型可能对由LPS诱导细胞的IL-10和IL-12分泌具有不同的调节作用；(4)表达GSK3β的4种亚型后,用LPS诱导细胞并用ELISA技术检测细胞培养液中的IL-10和IL-12含量。结果发现细胞分泌到培养液中的IL-10和IL-12量均出现显著增加P0.05)。其中GSK3β1的促进作用最为强烈,GSK3β3次之,GSK3β2和GSK3β5相对最弱；(5)利用qPCR检测不同时间的IGF-1处理下的GYSl和GYS2基因的表达模式。在外源添加物胰岛素样生长因子(IGF-1)的刺激下,GYSl的mRNA水平表达出现显著的上调变化而GYS2的mRNA水平的表达量没有显著变化；进一步发现在细胞中过表达GSK3β后,GYSl的mRNA表达水平出现极显著的下降,说明GSK3β影响GYS1的转录水平表达；(6)用双荧光素酶报告系统检测构建的GYSl的启动子片段活性以及GSK3β共转染GYS1的5个启动子片段后的其启动子的活性。结果发现,当其5个启动子片段单独转染后的相对荧光值较pGL3-basic有显著的提高(Pn05),其中片段+224/-350的活性显著高于+224-/147片段和+224-/539片段(P0.05)；而GSK3β与GYSl的5个启动子片段共转染后,pGL3-350/+224,pGL3-961/+224, pGL3-1488/+224这三个片段的启动子相对荧光值显著降低(P0.05),说明在GYSl基因的-147至-350,-350到-539以及-539至-961片段之间存在转录因子结合位点,且这些转录因子能被GSK3β调控。
【关键词】：猪 GSK3β 炎症反应 转录调控 糖原合成酶 启动子
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 常用符号缩写10-13
• 1 文献综述13-19
• 1.1 猪糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的研究进展13-18
• 1.1.1 GSK3的结构和表达分析13-14
• 1.1.2 GSK3β的活性调节14
• 1.1.3 GSK3β在信号通路中的作用14-16
• 1.1.4 GSK3β在炎症反应中的作用16-17
• 1.1.5 GSK3β蛋白对糖原合成酶的调控17-18
• 1.2 本研究的目的和意义18-19
• 2 材料与方法19-31
• 2.1 试验材料19-23
• 2.1.1 试验用细胞系及载体19
• 2.1.2 主要仪器设备19-20
• 2.1.3 主要试剂及试剂盒20-21
• 2.1.4 主要试剂的配制21-23
• 2.2 试验内容与方法23-31
• 2.2.1 试验一 猪GSK3β蛋白及其亚型对细胞分泌IL-10和IL-12的影响23-28
• 2.2.2 试验二 猪GSK3β对GYS1基因启动子活性的影响研究28-31
• 3 试验结果31-39
• 3.1 猪不同GSK3β亚型在脂多糖(LPS)诱导细胞下的对IL-10和IL-12的分泌影响31-35
• 3.1.1 LPS对猪GSK3β蛋白表达及磷酸化水平影响分析31-32
• 3.1.2 LiCl对猪GSK3β蛋白表达及其磷酸化水平影响分析32
• 3.1.3 LPS刺激下PK-15细胞的IL-10和IL-12分泌量分析32-33
• 3.1.4 LPS诱导下的GSK3β不同亚型的mRNA表达水平研究33-34
• 3.1.5 过表达不同GSK3β亚型对LPS诱导下细胞分泌IL-10和IL-12影响34-35
• 3.2 GSK3β蛋白对猪GYS1基因的转录调控35-39
• 3.2.1 猪GYS1和GYS2基因在IGF-1诱导下的mRNA表达模式35-36
• 3.2.2 过表达GSK3β对猪GYS1的mRNA表达水平影响研究36-37
• 3.2.3 猪GYS1基因的启动子活性分析37-38
• 3.2.4 GSK3β过表达对GYS1基因的启动子活性影响分析38-39
• 4 讨论39-44
• 4.1 猪GSK3β对LPS诱导下细胞分泌IL-10和IL-12的影响研究39-41
• 4.2 GSK3β对猪GYS1基因启动子活性的影响研究41-44
• 5 结论44
• 下一步研究44-46
• 参考文献46-53
• 致谢53-54
• 硕士阶段发表论文54

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