福州若干野生蕉ISSR分析、离体繁殖及APX克隆与表达分析

发布时间：2017-05-07 12:03

  本文关键词：福州若干野生蕉ISSR分析、离体繁殖及APX克隆与表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：香蕉(Musa spp.)是世界四大水果之一,同时也是重要的粮食作物,具有重大的经济价值,但常常遭遇低温等伤害,造成了不可估量的损失。因此加快培育出抗寒新品种成为了亟需解决的问题。而福建省具有丰富的优良抗性的野生蕉资源,可以为香蕉育种提供宝贵的种质资源和基因资源。因此急需开展对野生蕉离体繁殖和遗传背景的研究,进一步挖掘和利用野生蕉优良的抗性基因,完善香蕉抗寒性研究理论,为培育和改良香蕉新品种提供新的途径和奠定理论基础。本研究以福州晋安区的若干野生蕉为材料,在实验室前期研究的基础上,主要进行了日溪野生蕉遗传多样性的ISSR分析,宦溪野生蕉离体保存条件的研究,宦溪野生蕉APX家族基因的克隆、定量表达分析以及转化烟草等研究。主要结果如下：1福州日溪野生蕉自然群体遗传结构的ISSR分析本试验以福州市日溪乡自然居群的38份野生蕉样品为材料,采用ISSR分子标记并结合相关软件进行遗传结构分析。试验结果表明：筛选的13条引物共扩增得到116条DNA条带,多态性条带为70条,多态性条带百分率为60.34%,表明福州日溪野生蕉自然群体具有较高水平的遗传多样性；结合NTSYS和STRUCTURE聚类分析将38份野生蕉样品划分为6大类,结合Q值分析表明,福州日溪野生蕉群体内部存在着一定的遗传信息交流。2光质对福州宦溪野生蕉离体繁殖的影响以实验室继代保存的宦溪野生蕉组培苗为材料,研究不同光质(红光、蓝光、绿光、紫光、白光、黄光)对宦溪野生蕉组培苗的离体繁殖的影响。结果表明：1.白光条件下宦溪野生蕉增殖效果最好,红光下更有利于野生蕉的离体保存,其他光质培养下的组培苗形态会产生非正常变化。2.不同光质下叶绿素含量的测定白光处理下叶绿素含量最高。3.不同光质条件下测定的POD酶活性大小依次为：红光紫光绿光黄光蓝光白光；而CAT酶活性大小则为：白光黄光紫光蓝光绿光红光。3福州宦溪野生蕉APX家族基因克隆及生物信息学分析从宦溪野生蕉中分离得到APX家族基因7个成员的cDNA完整序列。其全长序列长度为1031 bp-1473 bp,编码氨基酸数目为249-426个。生物信息学分析表明：APX家族基因7个成员均是无信号肽的非分泌亲水蛋白,APX1-1、APX1-2和APX1-3蛋白稳定,其他四个不稳定；亚细胞定位预测表明：APX1-1、APX1-2、APX1-3定位于过氧化物酶体；APXS-1定位于线粒体基质空间；APXT-1定位于线粒体内膜和细胞质膜；APX4-1定位于内质网；APX4-2定位于细胞质膜；APX家族基因7个成员均具有KatG,PRK15061的保守结构域,属于plant_peroxidase_like超家族,其中APX1-2还属于ApbE superfamily超家族。APX1-2、APX1-3和APXS-1不存在跨膜结构,其他成员多具有由内向外的跨膜结构,磷酸化修饰以丝氨酸为主,苏氨酸和酪氨酸含量较少。二级结构由α螺旋、p转角、无规则卷曲以及伸展构象组成,其中以α螺旋和无规则卷曲为主,伸展构象次之,β转角所占比例最少。APX家族基因7个成员均有卷曲螺旋结构,三维结构近似球型。序列比对和系统进化分析表明：APX家族7个基因成员同源性较低,亲缘关系较远,预测APX家族基因成员的功能不同或具有协同作用。4福州宦溪野生蕉APX家族基因在不同温度下定量表达分析试验对宦溪野生蕉组培苗在不同温度下下的表达模式进行分析,结果表明：APX家族基因7个成员在不同温度下均有表达且表达模式不尽相同。APX1-1、APX1-3和APX4-2表达量变化呈“倒U型”；APXS-1和APXT-1在13℃处理下表达量达到极值,呈现“降-升-降-升”的模式；APX4-1呈现“先降后升”的模式；APX1-2则呈现“U型”表达模式,在28℃和0℃下均大量表达。5.福州宦溪野生蕉MuAPX1-2转化烟草研究本试验采用酶切连接法成功构建了MuAPX1-2基因的正义和反义-pCAMBIA 1301-(±)-Mu-APX1-2表达载体,成功转化到农杆菌EHA105感受态细胞中。采用农杆菌介导法转化烟草,对转基因烟草植株进行PCR检测和GUS检测,最终获得正义转化烟草17株,反义转化烟草20株,转基因植株阳性率为69.81%。目前已经获得了正义和反义TO代转基因烟草种子。
【关键词】：野生蕉 ISSR分子标记 离体繁殖 APX基因家族 表达分析
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S668.1
【目录】：

• 缩写词8-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-15
• 第一章 引言15-25
• 1 ISSR分子标记在芭蕉属植物的研究进展16-17
• 2 芭蕉属植物离体繁殖研究进展17-18
• 3 植物抗寒基因研究进展18-21
• 3.1 膜稳定相关基因18-19
• 3.2 抗氧化活性基因19
• 3.3 抗冻蛋白基因19-20
• 3.4 低温信号转录因子20
• 3.5 渗透调节基因20-21
• 4 芭蕉属植物抗寒分子生物学研究进展21-22
• 5 APX家族基因的研究进展22-23
• 6 本研究的意义和主要研究内容23-25
• 6.1 本研究的意义23-24
• 6.2 本研究的主要研究内容24-25
• 第二章 福州日溪野生蕉自然群体ISSR分析25-34
• 1 材料与方法25-26
• 1.1 材料25
• 1.2 方法25-26
• 2 结果与分析26-32
• 2.1 日溪野生蕉DNA提取与ISSR-PCR扩增26-27
• 2.2 日溪野生蕉自然居群的群体遗传结构分析27-31
• 2.3 日溪野生蕉自然居群的遗传多样性分析31-32
• 3 讨论32-34
• 3.1 福州市日溪野生蕉遗传多样性程度相对较高32
• 3.2 两种聚类分析方法结合有助于提高野生蕉样本聚类分析的准确性32-34
• 第三章 不同光质对福建野生蕉的增殖影响34-48
• 1 材料与方法34-35
• 1.1 材料34
• 1.2 方法34-35
• 2 结果和分析35-45
• 2.1 不同光质对宦溪野生蕉组培苗离体繁殖的影响35-44
• 2.2 不同光质下宦溪野生蕉组培苗离体保存中叶绿素含量的比较44
• 2.3 不同光质下宦溪野生蕉组培苗离体保存中过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的比较44-45
• 3 讨论45-48
• 3.1 光质对宦溪野生蕉离体繁殖的影响45-46
• 3.2 野生蕉组培苗叶绿素含量与成分在不同光质下的变化46-47
• 3.3 光质影响野生蕉组培苗POD和CAT酶活性的变化47-48
• 第四章 福建野生蕉APX家族7个成员的克隆48-62
• 1 材料与方法48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-50
• 2 结果与分析50-60
• 2.1 宦溪野生蕉总RNA的提取及其质量检测50-51
• 2.2 APX家族基因7个成员的克隆51-56
• 2.3 宦溪野生蕉与马来西亚小果野蕉APX家族7个成员基因ORF序列比对结果56-59
• 2.4 APX家族基因7个成员序列分析59-60
• 3 讨论60-62
• 3.1 APX家族基因成功克隆的研究意义60-61
• 3.2 宦溪野生蕉与马来西亚小果野蕉APX家族基因差异性的探讨61-62
• 第五章 福建野生蕉APX家族7个成员的生物信息学分析62-77
• 1 材料与方法62
• 1.1 材料62
• 1.2 方法62
• 2 结果分析62-75
• 2.1 宦溪野生蕉APX家族7个基因蛋白质基本理化性质预测与分析62-63
• 2.2 宦溪野生蕉APX家族基因7个成员蛋白质信号肽及亚细胞定位预测与分析63-64
• 2.3 宦溪野生家族基因7个成员蛋白质跨膜结构预n,与分析64-66
• 2.4 宦溪野生蕉APX家族基因7个成员蛋白质磷酸化位点预测与分析66-67
• 2.5 宦溪野生蕉APX家族基因7个成员蛋白质保守结构域预测与分析67-68
• 2.6 宦溪野生蕉APX家族基因7个成员卷曲螺旋结构预测与分析68-70
• 2.7 宦溪野生蕉APX家族基因7个成员蛋白质二级结构预测与分析70
• 2.8 宦溪野生蕉APX家族基因7个成员蛋白质三维结构预测与分析70-72
• 2.9 宦溪野生蕉APX家族基因7个成员系统进化树72
• 2.10 宦溪野生蕉APX家族基因cDNA序列分析72-73
• 2.11 宦溪野生蕉APX家族基因3'UTR与5'UTR多序列比对分析73-75
• 3 讨论75-77
• 3.1 宦溪野生蕉拥有结构与功能多样性的APX家族蛋白75-76
• 3.2 宦溪野生蕉APX家族可变剪接现象分析76-77
• 第六章 宦溪野生蕉APX家族基因定量表达分析77-84
• 1 材料与方法77-78
• 1.1 材料77
• 1.2 试剂及仪器77
• 1.3 方法77-78
• 2 结果与分析78-82
• 2.1 宦溪野生蕉不同温度处理下组培苗叶片总RNA的提取及质量分析79
• 2.2 实时荧光定量PCR扩增参照基因和APX家族基因参数分析79
• 2.3 宦溪野生蕉叶片不同温度处理下APX基因相对定量表达分析79-82
• 3 讨论82-84
• 3.1 APX家族基因不同成员对温度信号特异响应表达82-83
• 3.2 APX家族基因不同成员间协同互补共同抵抗逆境胁迫83-84
• 第七章 宦溪野生蕉MuAPX1-2遗传转化烟草研究84-90
• 1 材料与方法84-87
• 1.1 材料84-85
• 1.2 方法85-87
• 2 结果与分析87-89
• 2.1 宦溪野生蕉正义和反义载体构建及重组质粒的鉴定87
• 2.2 转基因植株检测87-89
• 3 讨论89-90
• 第八章 小结与展望90-92
• 参考文献92-102
• 附录Ⅰ 福州日溪乡自然居群38份样本ISSR-PCR凝胶电泳图谱102-109
• 附录Ⅱ 宦溪野生蕉不同光质下生长状况109-114
• 附录Ⅲ 宦溪野生蕉APX家族基因cDNA序列信息114-118
• 附录IV APX1-2基因转化烟草研究118-120
• 在学期间发表学术论文情况120-121
• 致谢121

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本文编号：349805