胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备

发布时间：2017-05-11 04:04

  本文关键词：胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本试验病原为胰腺炎型DHAV-1(MPZJ1206株),其所引起的病变与典型的DHAV-1有所不同,主要引起雏番鸭发生病变,发病的雏番鸭胰腺可见发黄和出血。将胰腺炎型DHAV-1与GenBank中登录的DHAV-1相比,发现其VP1基因核苷酸同源性在94.1%与99.1%之间,VP1基因推导氨基酸残基的同源性在96.8%与97.5%之间。本实验根据MPZJ1206株的VP1基因设计一对特异性引物,并采用RT-PCR法将目的VP1基因扩增,扩增产物回收纯化后,将其连接到克隆载体pMD18-T上,构建克隆载体pMD18-T-VP1,并将其转化到感受态细胞E.coli Trans5α。挑取单菌落,双酶切鉴定并测序,将鉴定为阳性的菌落提取质粒进行双酶切,回收VP1片段,将其与表达载体pGEX-6P-1进行连接。并将连接产物转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,鉴定同上,将鉴定为阳性的菌落经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳,并对其进行了鉴定。在此基础上对VP1蛋白的表达条件进行了优化。结果表明,表达的目的蛋白大小为53kDa,与预期相符,且具有反应原性,37℃诱导表达5h蛋白表达量达到最大,主要以包涵体的形式存在。将诱导表达的VP1蛋白作为抗原免疫BALB/C、鼠,共免疫四次。同时建立检测小鼠抗VP1抗体的间接ELISA检测方法。最后一次免疫后72h内取处于对数期生长的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞进行融合。融合后的杂交瘤细胞采用间接ELISA筛选阳性克隆,并进行亚克隆,结果共获得的2株杂交瘤细胞株均能稳定分泌抗DHAV-1的VP1蛋白单克隆抗体,分别命名为1A2、5G3,并对其稳定性,小鼠腹水的效价等进行检测。本实验表明,两株单克隆抗体具有稳定性好,效价较高,特异性良好的特点。1A2株效价可达1：25×103,5G3株效价可达1：211×103。亚类鉴定结果显示,两株细胞均为IgG1、κ链抗体。Western-blot表明两株单克隆抗体是针对DHAV-1的VP1蛋白。本实验获得的单克隆抗体为DHAV-1的治疗以及研制试剂盒对其进行检测打下了基础。
【关键词】：胰腺炎型DHAV-1 VP1蛋白 单克隆抗体
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-20
• 1.1 DHAV-1的流行特点及分布情况11-12
• 1.2 鸭1型甲肝病毒的理化特性及生物学特性12-13
• 1.3 鸭1型甲型肝炎病毒的特性和基因组结构13-15
• 1.3.1 鸭1型甲肝病毒非编码区14
• 1.3.2 鸭1型甲肝病毒编码区14-15
• 1.4 鸭1型甲肝病毒的检测方法15-17
• 1.4.1 中和试验15
• 1.4.2 HA和HI试验15
• 1.4.3 ELISA试验15-16
• 1.4.4 荧光抗体法16
• 1.4.5 胶体金法16
• 1.4.6 RT-PCR技术16-17
• 1.4.7 PCR-DHPLC17
• 1.4.8 RT-LAMP17
• 1.5 单克隆抗体技术17
• 1.6 小结17-20
• 2. 胰腺炎型DHAV-1的VP1基因的原核表达及鉴定20-32
• 2.1 实验材料及试剂20-21
• 2.1.1 实验病毒及试剂20
• 2.1.2 常用溶液的配置20-21
• 2.1.3 实验仪器21
• 2.2 实验方法21-25
• 2.2.1 引物设计21
• 2.2.2 目的基因的PCR扩增21-23
• 2.2.3 PCR产物的回收与克隆23-24
• 2.2.4 VP1重组蛋白的诱导表达条件的优化24-25
• 2.2.5 VP1蛋白的可溶性分析25
• 2.2.6 VP1蛋白的Western-blot鉴定25
• 2.3 实验结果25-31
• 2.3.1 VP1蛋白抗原表位的预测及序列分析25-26
• 2.3.1.1 VP1蛋白的抗原预测25-26
• 2.3.1.2 VP1蛋白的亲水性结构26
• 2.3.1.3 VP1蛋白的表面概率结构26
• 2.3.2 VP1基因的PCR扩增及双酶切鉴定26-28
• 2.3.3 VP1蛋白表达条件的优化28-29
• 2.3.4 VP1蛋白的可溶性分析结果29-30
• 2.3.5 胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白的Western-blot检测30-31
• 2.4 讨论31-32
• 3. 胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备32-49
• 3.1 实验材料及试剂32-33
• 3.1.1 实验细胞及动物32
• 3.1.2 主要试剂32
• 3.1.3 实验用液32-33
• 3.1.4 仪器设备33
• 3.2 单克隆抗体的制备33-39
• 3.2.1 小鼠的免疫33
• 3.2.2 胰腺炎型DHAV-1抗体的间接ELISA检测方法的建立33-35
• 3.2.3 饲养层细胞的制备35
• 3.2.4 骨髓瘤细胞的准备35-36
• 3.2.5 脾细胞的制备36
• 3.2.6 细胞融合36-37
• 3.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆37
• 3.2.8 杂交瘤细胞的冻存和复苏37-38
• 3.2.9 杂交瘤细胞的鉴定38
• 3.2.10 单克隆抗体腹水制备38-39
• 3.2.11 单克隆抗体腹水效价测定39
• 3.3 结果与分析39-47
• 3.3.1 检测胰腺炎型DHAV-1抗体的间接ELISA的建立39-42
• 3.3.1.1 纯化的胰腺炎型鸭1型甲肝病毒的蛋白定量39
• 3.3.1.2 最佳抗原稀释度及最佳血清稀释度的确定39-40
• 3.3.1.3 抗原最佳包被条件的确定40
• 3.3.1.4 最佳血清工作时间的确定40-41
• 3.3.1.5 酶标二抗最佳工作时间的确定41
• 3.3.1.6 临界值的确定41
• 3.3.1.7 免疫小鼠血清中的肝炎抗体效价水平的测定41-42
• 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立42-43
• 3.3.3 稳定性鉴定结果43-44
• 3.3.4 杂交瘤细胞的扩大培养44
• 3.3.5 Western-blot鉴定结果44-45
• 3.3.6 单克隆抗体的鉴定结果45-47
• 3.4 讨论47-49
• 3.4.1 抗原的选择与制备47
• 3.4.2 免疫动物的选择47
• 3.4.3 免疫彟的确定47
• 3.4.4 饲养细胞47-48
• 3.4.5 细胞融合48
• 3.4.6 单克隆抗体效价比较48-49
• 4 结论49-50
• 参考文献50-56
• 附录56-61
• 致谢61

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