黄帚橐吾内生真菌的分离鉴定及其代谢产物抑菌活性研究

发布时间：2017-05-12 13:17

  本文关键词：黄帚橐吾内生真菌的分离鉴定及其代谢产物抑菌活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：内生真菌是一个新的有待开发的微生物资源。不仅能从传统的药用植物中分离到有益内生真菌,在一些特殊环境下生长的其它植物也发现大量产活性代谢产物内生真菌,内生真菌对提高作物固氮、生物防控等方面起着重要的作用。本课题选择黄帚橐吾为研究对象,对植株的根、茎、叶三种组织的内生真菌进行分离纯化及初步鉴定。选用沙门氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌三种病原细菌为供试菌,研究黄帚橐吾内生真菌代谢产物的抑菌活性以及热、PH、紫外光对发酵液抑菌活性稳定性的影响；并对其抑菌活性较好的菌株进行了分子鉴定和发酵条件优化,研究结果如下：1.通过组织分离法,采用MEA和察氏3种分离培养基,共分离纯化得到黄帚橐吾内生真菌67株,从分布情况来看,根部分离最多为36株,茎、叶分别得到19株和12株,经典形态学分类方法进行初步鉴定,它们分属于5目5科9属,其中木霉属和镰孢属为优势菌属。2.对18株代表菌株发酵产物抑菌活性筛选研究发现,有14株菌对至少一种供试细菌具有抑菌活性(抑菌圈8mm),占总数的77.78%。其中,27.78%对E.coli具有较好抑菌活性(抑菌圈12mm),16.67%对Salmonella具有较好抑菌活性,44.44%对S.aureus具有较好抑菌活性。对抑菌活性最好的菌株N2进行形态学和分子鉴定确定其分类地位,为半知菌门、丝孢目、丛梗孢科、木霉属、棘孢木霉,最终定名为Trichoderma asperellum LB-N2 (Accession No:KM207842)。3.黄帚橐吾内生真菌N2发酵液稳定性结果显示：抑菌活性成分热稳定性一般,60℃以下具有较好的稳定性,在中性偏弱酸环境稳定性最佳,紫外光照对发酵液影响较小,不同时间紫外光照下发酵液活性基本保持一致。4.对碳源和氮源的选择上,黄帚橐吾内生真菌N2对小分子类碳源和有机氮源的利用率最高,在此培养基中生长最快。5.对黄帚橐吾内生真菌N2发酵液使用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯三种不同极性试剂萃取,研究结果表明,N2发酵液不同萃取相对指示菌的抑菌活性大小差异显著,乙酸乙酯相抑菌活性最佳,石油醚萃取相无抑菌活性。说明活性物质属强极性物质,主要集中于乙酸乙酯中。6.将菌株N2发酵液乙酸乙酯萃取相浓缩为浸膏,进行硅胶柱层析初步分离和抑菌活性跟踪试验,分离到2个较高活性组分用于进一步分离纯化,薄层层析结果显示为单一的褐色斑点,物质类型初步定性鉴定为生物碱和萜类物质。
【关键词】：黄帚橐吾 内生真菌 抑菌活性 分子鉴定 代谢产物
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.239;Q93
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1 植物内生真菌的研究进展12-17
• 1.1 植物内生真菌的定义12
• 1.2 植物内生真菌的生物多样性12-13
• 1.3 内生真菌生态学作用13-14
• 1.3.1 增强宿主抗性13-14
• 1.3.2 促进宿主生长发育14
• 1.3.3 增加宿主次生产物含量14
• 1.4 内生真菌代谢产物的研究14-17
• 1.4.1 抗生素类物质14-15
• 1.4.2 抗肿瘤物质15
• 1.4.3 杀虫类物质15-16
• 1.4.4 植物生长调节剂16
• 1.4.5 抗氧化物质16-17
• 1.4.6 其他类物质17
• 2 橐吾属植物的研究进展17-20
• 2.1 橐吾的概述17-18
• 2.2 橐吾的药理作用18-20
• 2.2.1 毒性作用18
• 2.2.2 抗氧化作用18-19
• 2.2.3 镇痛抗炎活性19
• 2.2.4 抗溃疡活性19
• 2.2.5 抗肿瘤、抗癌活性19-20
• 2.2.6 其他活性20
• 3 植物内生真菌抑菌活性物质研究进展20-22
• 3.1 生物碱类20
• 3.2 萜类物质20-21
• 3.3 多肽类21
• 3.4 脂肪族类21
• 3.5 呋喃类21-22
• 3.6 其他类22
• 4 研究的主要内容和意义22-24
• 4.1 研究的主要内容22
• 4.2 研究的意义22-24
• 第二章 黄帚橐吾内生真菌的分离纯化24-33
• 1 材料24-25
• 1.1 植物样本来源24
• 1.2 主要试剂24
• 1.3 主要仪器与设备24-25
• 1.4 培养基及其配制25
• 2 试验方法25-27
• 2.1 内生真菌的分离25-26
• 2.2 表面消毒效果检查26
• 2.3 内生真菌的纯化26
• 2.4 菌株保藏26
• 2.5 内生真菌的形态学鉴定26-27
• 3 结果与分析27-31
• 3.1 表面消毒效果的检查27
• 3.2 内生真菌分离结果27-31
• 4 讨论31-33
• 4.1 表面消毒条件的确立31-32
• 4.2 内生真菌分离纯化32-33
• 第三章 抑菌活性菌株筛选与鉴定33-41
• 1 材料试剂与仪器33-35
• 1.1 材料33
• 1.2 主要试剂33-34
• 1.3 主要仪器34-35
• 2 试验方法35-36
• 2.1 内生真菌代谢产物制备35
• 2.2 菌悬液的制备35
• 2.3 抑菌活性菌种的筛选35
• 2.4 抑菌活性菌种的分子鉴定35-36
• 2.4.1 DNA的提取和纯化35-36
• 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳36
• 2.4.3 ITS片段的PCR扩增36
• 2.4.4 ITS片段的测序36
• 3 结果与分析36-39
• 3.1 抑菌活性菌株的筛选36-38
• 3.2 活性菌株鉴定38-39
• 3.2.1 形态学鉴定38
• 3.2.2 内生真菌N2分子鉴定38-39
• 4 讨论39-41
• 4.1 抑菌活性菌株的筛选39-40
• 4.2 内生真菌鉴定40-41
• 第四章 N2发酵液抑菌活性稳定性及培养基优化41-48
• 1 材料试剂与仪器41-42
• 1.1 材料41
• 1.2 主要试剂41
• 1.3 主要仪器41-42
• 2 试验方法42-43
• 2.1 热稳定性分析42
• 2.2 酸碱稳定性42
• 2.3 紫外光照射稳定性42-43
• 2.4 碳源、氮源的筛选43
• 3 结果与分析43-46
• 3.1 热稳定性43
• 3.2 酸碱稳定性43-44
• 3.3 紫外光照稳定性44
• 3.4 不同碳源对菌株N2生长影响44-45
• 3.5 不同氮源对菌株N2生长影响45-46
• 4 讨论46-48
• 4.1 发酵液稳定性分析46-47
• 4.2 不同碳源氮源对菌株N2的影响47-48
• 第五章 发酵液活性物质提取、分离和初步鉴定48-54
• 1 试剂与仪器48-49
• 1.1 主要试剂48
• 1.2 主要仪器48-49
• 2 试验方法49-51
• 2.1 活性物质极性分析49
• 2.2 活性物质的初步分离49-50
• 2.2.1 硅胶柱层析49-50
• 2.2.2 薄层层析50
• 2.3 有效活性物质定性分析50-51
• 2.3.1 黄酮类物质检测50
• 2.3.2 生物碱类检测50-51
• 2.3.3 酚类物质检测51
• 2.3.4 蒽醌类物质检测51
• 2.3.5 萜类物质检测51
• 3 结果与分析51-53
• 3.1 抑菌活性物质极性分析51-52
• 3.2 乙酸乙酯萃取相的提取分离52-53
• 3.3 组分3和4的分离纯化与初步鉴定53
• 4 讨论53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-63
• 致谢63-64
• 攻读硕士间发表的论文64-65
• 附录65-66

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 郭良栋;内生真菌研究进展[J];菌物系统;2001年01期

2 任安芝,高玉葆;禾草类内生真菌的研究进展[J];微生物学通报;2004年02期

3 何颖;谈锋;谢建平;;红豆杉内生真菌产紫杉醇研究进展[J];天然产物研究与开发;2006年03期

4 孙端方;冉雪琴;王嘉福;;一株产紫杉醇罗汉松内生真菌的分离和鉴定[J];微生物学报;2008年05期

5 严菊芬;王素萍;齐宁波;陈君;毛俊;杨树林;;药用植物内生真菌研究进展[J];天然产物研究与开发;2012年S1期

6 古海刚;白红进;曾艳波;常东东;梅文莉;;中国红树植物角果木内生真菌的分离及其初步鉴定[J];微生物学杂志;2012年06期

7 梁宇,高玉葆;内生真菌对植物生长发育及抗逆性的影响[J];植物学通报;2000年01期

8 陈贤兴,陈析丰,南旭阳,何献武;喜树果内生真菌的分离与鉴定[J];河南科学;2003年04期

9 孙翔;李文超;郭守玉;郭良栋;;内生真菌V．中国树木和地衣内生真菌三个新记录属种(英文)[J];菌物学报;2007年02期

10 侯奎;刘玉军;陆荣;刘小娟;周芸;樊美珍;;葛内生真菌次生代谢产物清除自由基活性的研究[J];安徽农业大学学报;2008年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 郭良栋;;内生真菌研究进展与展望[A];中国菌物学会第四届会员代表大会暨全国第七届菌物学学术讨论会论文集[C];2008年

2 张琦;严铸云;汪杨丽;陈新;万德光;;家种和野生丹参内生真菌初步比较[A];中华中医药学会第九届中药鉴定学术会议论文集——祝贺中华中医药学会中药鉴定分会成立二十周年[C];2008年

3 陈法军;黄永青;叶万辉;;内生真菌及其意义[A];生物多样性研究进展——首届全国生物多样性保护与持续利用研讨会论文集[C];1994年

4 严铸云;戴国君;马云桐;张琦;陈新;万德光;;丹参内生真菌与其有效成分的相关性研究[A];第九届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2010年

5 陈鹊;魏超;吴卫;;药用新资源—内生真菌[A];全国第9届天然药物资源学术研讨会论文集[C];2010年

6 陆涛;高龙;纪燕玲;王志伟;;温度处理对鹅观草种子内生真菌垂直传播能力的影响[A];中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集[C];2011年

7 张猛;;小麦和玉米内生真菌的分离与鉴定[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年

8 陈贤兴;陈析丰;南旭阳;何献武;;喜树果内生真菌的分离与鉴定[A];全面建设小康社会：中国科技工作者的历史责任——中国科协2003年学术年会论文集（上）[C];2003年

9 杨民和;王国红;;茶树内生真菌资源及其利用潜力[A];第四届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文集[C];2012年

10 严铸云;郭晓恒;宋杰;;濒危中药替代品的新资源——内生真菌[A];中华中医药学会第九届中药鉴定学术会议论文集——祝贺中华中医药学会中药鉴定分会成立二十周年[C];2008年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 李晓彬;五株内生真菌的化学成分及其生物活性研究[D];山东大学;2015年

2 宋梅玲;野大麦内生真菌共生体耐盐性的生理机制研究[D];兰州大学;2015年

3 周连玉;基于代谢组学的中华羊茅-内生真菌共生体响应低温胁迫的生化机制[D];兰州大学;2015年

4 马敏芝;多年生黑麦草—内生真菌共生体抗病性及其对根腐离蠕孢（Bipolaris sorokiniana）抗病机制的研究[D];兰州大学;2015年

5 陈丽;醉马草内生真菌分子检测、基因型及产碱多样性的研究[D];兰州大学;2015年

6 易晓华;除虫菊内生真菌分离、鉴定及其代谢产物抑菌活性研究[D];西北农林科技大学;2008年

7 胡克兴;石斛属药用植物内生真菌多样性研究[D];中国协和医科大学;2008年

8 何璐;苦参内生真菌抑菌物质纯化鉴定及作用机制研究[D];沈阳农业大学;2011年

9 袁志林;疣粒野生稻（Oryza granulata）内生真菌资源挖掘、系统发育分析和功能初探[D];浙江大学;2010年

10 朱敏杰;内蒙古中东部草原羊草内生真菌多样性及其对宿主生理生态特性的影响[D];南开大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 马聪聪;三尖杉两株内生真菌次生代谢产物的研究[D];陕西科技大学;2015年

2 李婷;黑果枸杞内生真菌R43的次生代谢产物的研究[D];陕西科技大学;2015年

3 向建辉;黄连内生真菌中小檗碱的分离与鉴定[D];西北农林科技大学;2015年

4 毛光瑞;陕西核桃内生真菌多样性及其抑菌活性初步研究[D];西北农林科技大学;2015年

5 张影珍;猫儿屎内生真菌DS58次生代谢产物的研究[D];陕西科技大学;2015年

6 孝杰;三株中药内生真菌次生代谢产物研究[D];兰州大学;2015年

7 赵晓静;禾草内生真菌显微结构及其检测方法的研究[D];兰州大学;2015年

8 韩阳;两株植物内生真菌和一种药用植物的活性成分研究[D];山东大学;2015年

9 龚倩;银杏内生真菌抗菌、抑菌活性的初步研究[D];安徽工程大学;2015年

10 周燕燕;紫玉盘内生真菌Arthrinium sp.次级代谢产物研究[D];广东药学院;2015年

  本文关键词：黄帚橐吾内生真菌的分离鉴定及其代谢产物抑菌活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：359891