山羊Tet蛋白家族主要组织表达检测及其Tet3CDS区克隆和生物信息学分析

发布时间：2017-05-13 19:05

  本文关键词：山羊Tet蛋白家族主要组织表达检测及其Tet3CDS区克隆和生物信息学分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：DNA去甲基化在哺乳动物早期胚胎发育和体细胞重编程过程中是必不可少的过程,而Tet蛋白家族在DNA去甲基化过程中发挥重要的作用。研究表明,Tet3蛋白是小鼠早期胚胎发育过程中雄原核主动去甲基化的关键酶,也是胚胎发育所必需的蛋白因子。然而,不同物种的DNA去甲基化模式不同,并且山羊早期胚胎发育过程中Tet3蛋白的去甲基化机制尚不清楚,另外研究表明克隆胚胎普遍存在DNA去甲基化不完全的现象,这可能是导致克隆动物效率低的一个原因。山羊Tet3蛋白能否提高克隆胚胎DNA甲基化重编程效率、降低甲基化异常概率,还不能确定。基于此,本实验利用Real-Time PCR方法检测山羊Tet蛋白家族基因各组织的相对表达量,通过Touchdown PCR方法从高表达Tet3的肝脏组织分三段扩增Tet3 CDS区,通过In-Fusion Cloning扩增山羊Tet3CDS区全长,并构建pEGFP-N1-Tet3表达载体用于后续实验,通过ExPAsy、MEGA、Net Pho、NetNGlyc、SOPMA、SWISS-MODEL和STRING等生物信息学分析工具对山羊Tet3基因进行分析及预测,为进一步研究Tet3蛋白对山羊早期胚胎DNA甲基化重编程的作用提供理论参考和技术支持。本研究的主要内容和结果如下:1.山羊Tet蛋白家族基因在各组织中的相对定量表达检测采取3只山羊的12个组织,利用Trizol方法提取各组织Total RNA,通过RT-PCR得到cDNA。在NCBI上通过比对寻找山羊Tet蛋白家族各基因保守序列,设计定量引物。采用Real-Time PCR方法检测山羊各组织中Tet蛋白家族基因的相对表达量,通过SPSS软件对实验结果进行统计学分析。根据Real-Time PCR,选取心脏组织为基准样品(1),利用相对定量2-ΔΔCт方法,结果表明山羊Tet1在皮肤(20.05)、脾脏(11.10)和卵巢(7.70)中相对表达量较高;山羊Tet2在脾脏(13.89)中相对表达量最高;山羊Tet3在脾脏(59.32)、胰腺(53.95)、肺脏(47.22)、卵巢(39.58)相对表达量较高。2.山羊Tet3 CDS区全长序列的分段扩增及CDS全长序列的In-Fusion Cloning选取Tet3高表达的肺脏组织,提取Total RNA,通过RT-PCR得到cDNA。通过NCBI比对预测山羊Tet3 mRNA序列并根据此序列将包含Tet3 CDS全长的mRNA分三段设计引物进行PCR扩增;采用Touchdown PCR并在PCR体系中添加二甲基亚砜来扩增山羊高GC Tet3各片段,测序并拼接得到包含山羊Tet3 CDS区全长序列的Tet3 m RNA部分序列;用In-Fusion Cloning方法克隆全长4902 bp的山羊Tet3 CDS区,双酶切鉴定正确。3.山羊Tet3 pEGFP-N1-Tet3表达载体的构建分别用Hind III和EcoR I双酶切In-Fusion Cloning得到的带有Tet3 CDS区的质粒和pEGFP-N1质粒,胶回收纯化线性化载体和Tet3 CDS区目的片段,通过连接构建pEGFP-N1-Tet3表达载体,经酶切鉴定证明pEGFP-N1-Tet3表达载体构建成功。4.山羊Tet3基因生物信息学分析利用ExPAsy、MEGA、NetPho、NetNGlyc、SOPMA、SWISS-MODEL和STRING等生物信息学分析工具分析山羊Tet3基因,分析结果表明:山羊Tet3和藏羚羊、牛、野牛的同源性大于97%,而同小鼠和人类的同源分别为85%及89%;山羊Tet3蛋白是一个由游离核糖体合成的、无信号肽、亲水性、定位在细胞核内具有去甲基化作用的Tet_JBP结构功能域的蛋白。
【关键词】：山羊 Tet3 Real-Time In-Fusion Cloning 生物信息学分析
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827;Q78
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文献综述12-32
• 第一章 DNA甲基化和Tet蛋白的去甲基化12-32
• 1.1 哺乳动物体细胞重编程的研究进展12-19
• 1.1.1 体细胞重编程现象的发现12-13
• 1.1.2 体细胞重编程方法13-19
• 1.2 DNA甲基化和Tet蛋白的去甲基化19-27
• 1.2.1 DNA甲基化20-21
• 1.2.2 DNA去甲基化21-23
• 1.2.3 Tet蛋白家族23-27
• 1.3 无缝克隆27-32
• 1.3.1 无缝克隆的概述27-28
• 1.3.2 同源重组28-29
• 1.3.3 无缝克隆的实验方法29-32
• 实验研究32-70
• 第二章 山羊Tet蛋白家族基因在主要组织中的相对定量表达检测32-50
• 2.1 实验材料32-34
• 2.1.1 组织样品、感受态细菌、载体来源32-33
• 2.1.2 仪器设备33
• 2.1.3 主要试剂及配置33-34
• 2.2 试验方法34-41
• 2.2.1 山羊各组织的采取34-35
• 2.2.2 山羊各组织Total RNA的提取35
• 2.2.3 山羊各组织Total RNA第一链cDNA的合成35-36
• 2.2.4 山羊Tet蛋白家族定量引物设计36-37
• 2.2.5 山羊GAPDH及山羊Tet蛋白家族基因定量引物的验证37-40
• 2.2.6 山羊Tet蛋白家族基因实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)40-41
• 2.3 结果41-48
• 2.3.1 山羊各组织Total RNA纯度和浓度检测结果41-42
• 2.3.2 山羊各组织Total RNA第一链cDNA合成质量检测结果42-43
• 2.3.3 山羊Tet蛋白家族基因定量引物检测结果43
• 2.3.4 山羊Tet蛋白家族基因定量引物PCR扩增序列测序比对结果43-45
• 2.3.5 山羊Tet蛋白家族Real-Time PCR结果及分析45-48
• 2.4 讨论48-49
• 2.5 小结49-50
• 第三章 In-Fusion Cloning扩增高GC山羊Tet3 CDS全长及其生物信息学分析50-70
• 3.1 实验材料50-51
• 3.1.1 pUC19载体、感受态细菌、山羊肺脏组织来源50
• 3.1.2 试剂50-51
• 3.1.3 仪器设备51
• 3.2 实验方法51-57
• 3.2.1 山羊Tet3 mRNA和CDS序列的预测51
• 3.2.2 山羊肺脏组织Total RNA提取和反转录第一链c DNA的合成51-52
• 3.2.3 山羊Tet3 CDS全长序列的Touchdown PCR法分段扩增52-54
• 3.2.4 In-Fusion Cloning扩增山羊Tet3 CDS全长序列54-56
• 3.2.5 pEGFP-N1-Tet3表达载体的构建56
• 3.2.6 山羊Tet3生物信息学分析56-57
• 3.3 结果57-67
• 3.3.1 预测得到山羊Tet3 mRNA和CDS序列57
• 3.3.2 利用Touchdown PCR扩增山羊Tet3 mRNA 3 段分段产物57-58
• 3.3.3 In-Fusion Cloning扩增山羊Tet3 CDS全长序列鉴定结果58-59
• 3.3.4 pEGFP-N1-Tet3表达载体双酶切鉴定结果59-60
• 3.3.5 山羊Tet3蛋白生物信息学预测60-67
• 3.4 讨论67-68
• 3.5 小结68-70
• 全文结论70-71
• 参考文献71-79
• 致谢79-80
• 作者简介80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 吴畏;徐海伟;屈娅;阴正勤;;细胞融合致体细胞重编程机制研究进展[J];生命科学;2012年04期

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本文编号：363353