牙鲆（Paralichthys olivaceus）TRAF6基因和TAK1基因的克隆及免疫应答研究

发布时间：2017-05-14 11:10

  本文关键词：牙鲆（Paralichthys olivaceus）TRAF6基因和TAK1基因的克隆及免疫应答研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牙鲆(Paralichthys olivaceus)为冷温性底栖鱼类,是我国重要的经济鱼类。近年来,随着高密度集约化养殖规模的扩大,鱼类疾病的传染也日益严重,养殖场中鱼类大规模的死亡及其造成的重大经济损失给人工养殖提出了严峻挑战。因此,深入研究牙鲆的抗病免疫机制,探寻增强养殖品种免疫力的途径和方法,培育牙鲆抗病新品系,对于牙鲆养殖规模的扩大十分重要。Toll样受体(TLRs)可识别病原相关分子模式(PAMPs),是模式识别受体(PRRs)家族中的成员,在先天性免疫反应中发挥着重要的作用。TLRs识别并结合相应的配体后,可激活细胞内的信号转导途径,诱导促炎细胞因子的分泌和共刺激分子的表达,启动特异性免疫应答反应。TRAF6和TAK1是Toll样受体信号通路中两个重要的接头蛋白,可激活下游信号通路,启动固有免疫应答反应和特异性免疫应答反应。本研究克隆到了TRAF6基因和TAK1基因的cDNA全长,并对其蛋白序列、调控区域及表达模式进行了初步分析,为进一步研究这两个基因在免疫反应中的作用机理提供了理论依据。牙鲆TRAF6基因cDNA全长1953 bp,包括1713 bp的开放阅读框(ORF),159 bp的5'UTR和81 bp的3'UTR,预测该基因编码570个氨基酸。利用在线软件分析了牙鲆TRAF6基因的蛋白结构域,包括N端的RING结构域,两个锌指结构域,一个环-环(coiled-coil)a螺旋结构域以及高度保守的MATH结构域。牙鲆TRAF6与巨石斑鱼TRAF6的一致性高达91%。系统进化树分析表明,牙鲆TRAF6和半滑舌鳎TRAF6聚为一支,亲缘关系最近。对其调控区进行初步的生物信息学分析,预测存在丰富的转录因子结合位点,多为参与调控炎症反应的转录因子,预示了他们在免疫应答反应中的潜在功能。荧光定量PCR结果显示牙鲆TRAF6基因广泛的表达于各组织中,但其表达量存在显著的差异,在肠和心脏中有较高的表达。TRAF6在肠等免疫器官中的高表达,与其在Toll样受体信号通路中的重要作用是一致的。对牙鲆早期胚胎发育不同时期TRAF6基因的表达情况进行检测。结果显示,TRAF6基因在所有时期都有表达,包括未受精卵,提示了TRAF6基因的母源性表达。免疫分子母源性mRNA的存在可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。免疫刺激实验表明,LPS、poly I:C和CpG ODN都可以上调TRAF6基因的表达。牙鲆TAK1基因cDNA全长2086 bp,其中包括ORF 1728 bp,5'UTR 232 bp, 3'UTR 128 bp,根据其完整的ORF预测TAK1基因编码575个氨基酸残基的蛋白。牙鲆TAK1基因与其他物种的一致性很高,与点带石斑鱼的一致性高达97%。牙鲆TAK1蛋白包括一个蛋白激酶ATP结合结构域,一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶激活结构域以及羧基端的环-环(coiled-coil) a螺旋结构域。对其调控区进行初步的生物信息学分析,预测存在丰富的转录因子结合位点,多为参与调控炎症反应的转录因子,预示了他们在免疫应答反应中的潜在功能。荧光定量PCR结果显示牙鲆TAK1基因在所检测的所有组织中都有表达,但其表达量存在明显的差异,在肠和心脏中有较高的表达。对牙鲆早期胚胎发育不同时期TAK1基因的表达情况进行检测。结果显示,TAK1基因在所有时期都有表达,包括未受精卵,提示了TAK1基因的母源性表达。免疫分子母源性mRNA的存在可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。免疫刺激实验表明,LPS、polyI:C和CpG ODN都可以上调TAK1基因的表达。
【关键词】：牙鲆 TRAF6 TAK1 基因克隆 启动子 表达分析
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文献综述12-28
• 第一节 Toll样受体信号通路研究进展13-20
• 1 Toll样受体的结构及其功能13-14
• 2 TLRs识别的配体14-16
• 3 Toll样受体信号转导途径16-17
• 4 TLRs的生物学功能17-18
• 5 Toll样受体与疾病18-19
• 6 Toll样受体在鱼类中的研究进展19-20
• 第二节 TRAF6基因简介20-23
• 1 TRAF简述20-21
• 2 TRAF的生物学功能21-22
• 3 TRAF622-23
• 第三节 TAK1基因简介23-27
• 1 TAK1的结构23-24
• 2 TAK1激酶活化反应24-25
• 3 TAK1激酶失活反应25
• 4 TAK1信号转导通路25-26
• 5 TAK1与细胞凋亡26-27
• 第四节 本研究的目的、意义及实验设计27-28
• 第二章 牙鲆TRAF6基因的克隆及表达分析28-47
• 引言28-29
• 1 实验材料29-31
• 1.1 实验动物及取材29-30
• 1.2 实验试剂30
• 1.3 实验引物30-31
• 2 实验方法31-37
• 2.1 总RNA的提取、检测、纯化和反转录31-32
• 2.2 牙鲆TRAF6基因核心片段的获得32-33
• 2.3 TRAF6基因cDNA全长的获得33-34
• 2.4 牙鲆TRAF6基因及蛋白序列分析34-35
• 2.5 牙鲆TRAF6启动子区序列分析35
• 2.6 牙鲆TRAF6基因的组织差异性表达35-36
• 2.7 牙鲆TRAF6基因不同发育时期的差异性表达36
• 2.8 免疫刺激后基因表达的变化36-37
• 3 结果37-43
• 3.1 牙鲆TRAF6基因全长的获得37-39
• 3.2 牙鲆TRAF6基因的系统进化树分析39-40
• 3.3 牙鲆TRAF6基因启动子序列的生物信息学分析40-41
• 3.4 牙鲆TRAF6基因的组织表达分析41
• 3.5 牙鲆TRAF6基因的早期胚胎发育表达分析41-42
• 3.6 免疫刺激后牙鲆TRAF6基因的表达变化42-43
• 4 讨论43-47
• 第三章 牙鲆TAK1基因的克隆及表达分析47-60
• 引言47-48
• 1 材料与方法48-50
• 1.1 实验动物及取材48
• 1.2 实验所用引物48-49
• 1.3 牙鲆TAK1基因核心片段的获得49
• 1.4 牙鲆TAK1基因3’和5’末端的获得49
• 1.5 牙鲆TAK1基因及蛋白序列分析49
• 1.6 牙鲆TAK1基因启动子区的获得和分析49-50
• 1.7 牙鲆TAK1基因的组织差异性表达50
• 1.8 牙鲆TAK1基因不同发育时期的差异性表达50
• 1.9 免疫刺激后TAK1基因表达的变化50
• 2 结果50-57
• 2.1 牙鲆TAK1基因全长分析结果50-53
• 2.2 牙鲆TAK1基因的系统进化树分析53-54
• 2.3 牙鲆TAK1基因启动子序列的生物信息学分析54
• 2.4 牙鲆TAK1基因的组织表达分析54-55
• 2.5 牙鲆TAK1基因的早期胚胎发育表达分析55
• 2.6 免疫刺激后牙鲆TAK1基因的表达变化55-57
• 3 讨论57-60
• 参考文献60-70
• 致谢70-71
• 个人简历71

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8 张文;张p

本文编号：365001