H5和H7亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
发布时间：2017-05-14 11:22
本文关键词：H5和H7亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种人兽共患传染病,呈世界性的存在和发生。其宿主范围十分广泛,主要宿主为水生禽类,同时也可以感染哺乳动物和人类。一般情况下,禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)并不感染人类,但自1997年发生H5N1亚型禽流感病毒感染人类事件之后,相继有不同亚型禽流感病毒感染人病例出现。尤其是2013年H7N9亚型流感病毒在我国的流行,不仅给家禽养殖业带来了巨大的损失,同时造成多起人类感染该病毒死亡的事件。因此,及时开展针对流感病毒的诊断研究,对防止流感大范围流行,降低对动物及人类生命安全的危害具有重要意义。荧光定量RT㧟PCR技术(Real-time RT-PCR)是一种新型的分子核酸检测技术。本研究借助实验室已有工作平台,建立了可以检测H5和H7亚型禽流感病毒的荧光定量RT-PCR方法。根据H5N1亚型流感病毒HA和H7N9亚型流感病毒HA和NA基因序列,设计并合成相关探针和引物,建立了检测H5和A型流感病毒双重荧光定量RT-PCR和H7N9亚型及A型流感病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法。用背景清楚的H1~H16、N1~N9亚型A型流感病毒和多种其它病原评价两种方法,均表现出了较好的特异性;在敏感性试验中,检测10倍系列稀释的H5N1和H7N9亚型病毒尿囊液的最高稀释度可以达到10-5;在重复性试验中,两种方法Cp值变异系数均2%,重复性较好;经过分析大量临床拭子的检测结果,该检测方法与病毒分离鉴定的符合度较高。兽用生物制品标准物质可用于兽用微生物及其产物的定性鉴定或定量测定动物疫病诊断试剂及兽用生物制品生物效价等特性值或验证检验和诊断方法准确性的参考品。本研究利用H5N1和H7N9亚型灭活病毒制备了标准物质,在热稳定性试验中,分别在-20℃、4℃、37℃不同温度下保存一定时间,仍可以表现出较好的稳定性;在反复冻融试验中,经过反复16次冻融之后仍可以作为参考标准,发现标准物质较为稳定;无菌试验鉴定符合要求,同时标准物质灭活充分,可以为普通RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法提供参考。
【关键词】：禽流感 荧光定量RT-PCR 标准物质
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：
- 摘要5-6
- Abstract6-9
- 英文缩略表9-10
- 第一章 引言10-18
- 1.1 禽流感病毒综述10-13
- 1.1.1 AIV的组成结构10-11
- 1.1.2 AIV主要蛋白11-13
- 1.2 AI流行概况13-14
- 1.2.1 H5亚型AI的流行及危害13
- 1.2.2 新型H7N9流感病毒的出现13-14
- 1.3 AIV的诊断14-16
- 1.3.1 病毒分离与鉴定14
- 1.3.2 血清学检测方法14-15
- 1.3.3 分子生物学检测方法15-16
- 1.4 生物制品标准物质概述16-17
- 1.4.1 基本定义16-17
- 1.4.2 分类17
- 1.4.3 作用17
- 1.5 研究的目的和意义17-18
- 第二章 H5和H7亚型AIV荧光定量RT-PCR检测方法的建立18-30
- 2.1 试验材料18-20
- 2.1.1 病毒18-19
- 2.1.2 试剂19
- 2.1.3 主要仪器设备19-20
- 2.2 试验方法20-22
- 2.2.1 设计引物和探针20
- 2.2.2 病毒核酸提取20-21
- 2.2.3 标准品核酸RNA浓度的测定及拷贝数计算21
- 2.2.4 荧光定量RT-PCR反应条件的优化21
- 2.2.5 绘制标准曲线和病毒的定量21-22
- 2.2.6 性能评估22
- 2.3 试验结果22-29
- 2.3.1 荧光定量RT-PCR反应条件的优化结果22
- 2.3.2 标准曲线绘制22-25
- 2.3.3 性能评估25-29
- 2.4 讨论29-30
- 第三章 H5和H7亚型AIV核酸检测标准物质的制备30-40
- 3.1 试验材料30
- 3.1.1 病毒30
- 3.1.2 试剂30
- 3.2 试验方法30-32
- 3.2.1 标准物质半成品的制备与检验30-31
- 3.2.2 标准物质候选品的制备与检验31
- 3.2.3 病毒核酸的提取31-32
- 3.2.4 稳定性试验32
- 3.3 试验结果32-39
- 3.3.1 标准物质半成品的制备与检验结果32-33
- 3.3.2 标准物质候选品的制备与检验结果33
- 3.3.3 稳定性试验结果33-39
- 3.4 讨论39-40
- 第四章 全文结论40-41
- 参考文献41-47
- 致谢47-48
- 作者简历48
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 丁丽霞;周海钧;;生物标准物质的研究和技术要求(上)[J];中国药师;2007年03期
本文关键词：H5和H7亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。
本文编号：365065
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