舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶基因催化区截短和定点突变的研究

发布时间：2017-05-14 12:20

  本文关键词：舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶基因催化区截短和定点突变的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：舞毒蛾遍及世界各地,对林业造成了极其严重的威胁。对舞毒蛾的防治可以从多个方向着手,目前大致包括性信息素诱导等生物方向防治,还有人工收集虫卵等人工防治以及最为传统的农药喷洒等的化学治理。在近几年里,利用生物方法对舞毒蛾进行防治越来越受到人们的关注。在舞毒蛾的表皮以及中肠围食膜中都存在大量的几丁质,它是一种由β-1,4糖苷键连接多个N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)形成的线性多糖,在昆虫的生长和发育过程中,几丁质周期性的产生和降解对其生长发育起着关键性的作用。几丁质酶可以降解几丁质,生物防治就是利用这一机制,本课题通过对舞毒蛾几丁质酶基因催化区的截短和定点突变做相关研究,深入分析几丁质酶催化其底物几丁质降解的催化机制,为更加深入的利用其高效的杀虫提供相应的理论方面支持。本研究首先将舞毒蛾I型几丁质酶基因(LdCHT5)利用PCR技术进行催化区截短和定点突变,得到四种催化区截短基因分别为LdCHT5-N20, LdCHT5-N60, LdCHT5-C20, LdCHT5-C60,以及六种催化区定点突变基因,LdCHT5-D143A, LdCHT5-D143E, LdCHT5-D143N, LdCHT5-D145A, LdCHT5-D145E, LdCHT5-D145N。并将这些基因都连接到一个用于真核表达的载体中,再利用Bac to Bac表达系统,获得含各目的基因的相应穿梭载体Bacmid-LdCHT5-N20,Bacmid-LdCHT5-N60,Bacmid-LdCHT5-N20, Bacmid-LdCHT5-N60,Bacmid-LdCHT5-D143A,Bacmid-LdCHT5-D143E,Bacmid-LdCHT5-D143N, Bacmid-LdCHT5-D145A, Bacmid-LdCHT5-D145E, Bacmid-LdCHT5-D145N),利用转染试剂cellfectin reagent将其转染到草地贪夜蛾细胞Sf9中,进而表达目的蛋白。两类蛋白的纯化方式都是通过将粗蛋白过Ni-NTA镍柱做相应的纯化,经除杂纯化以后的各蛋白可以为下一步更深层次的研究相应的酶学性质提供基础。对蛋白酶学活性的研究利用CM-chitin-RBV为底物,研究表明,催化区截短的四种蛋白均没有酶活,不利于后续实验。而定点突变后的催化区相关实验结果显示：在六个突变体中,D143N具有较高的活性,D143E次之,分别保留了野生型酶活的84%,65%。D145E, D145N丧失了一半以上的酶活,而D143A, D145A相对于野生型几丁质酶来说几乎失去90%以上的酶活。
【关键词】：舞毒蛾 几丁质酶 截短 定点突变 真核表达系统 酶学活性
【学位授予单位】：太原理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S763.42
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-12
• 第一章 绪论12-24
• 1.1 舞毒蛾12-15
• 1.1.1 舞毒蛾分布12
• 1.1.2 舞毒蛾的防治12-15
• 1.2 几丁质15-17
• 1.2.1 几丁质的分布15-16
• 1.2.2 几丁质的分类16
• 1.2.3 几丁质的生物合成16
• 1.2.4 几丁质的化学合成16-17
• 1.2.5 几丁质的功能17
• 1.3 几丁质酶17-19
• 1.3.1 几丁质酶的分布17
• 1.3.2 几丁质酶的分类17-18
• 1.3.3 几丁质酶酶活的测定方法18
• 1.3.4 几丁质酶的应用18-19
• 1.4 昆虫几丁质酶19-20
• 1.4.1 昆虫几丁质酶的分布19
• 1.4.2 昆虫几丁质酶分类19-20
• 1.4.3 昆虫几丁质酶的功能20
• 1.5 舞毒蛾几丁质酶催化区20-21
• 1.6 定点突变21-22
• 1.6.1 定点突变概述21
• 1.6.2 实验中用到的的定点突变技术21-22
• 1.6.3 定点突变的潜在应用22
• 1.7 本论文研究的目的及意义22-23
• 1.7.1 催化区截短的研究22-23
• 1.7.2 催化区定点突变的研究23
• 1.8 本研究课题的主要来源和主要内容23-24
• 第二章 表达载体构建24-44
• 2.1 引言24
• 2.2 实验材料24-27
• 2.2.1 实验菌株及载体24-25
• 2.2.2 实验试剂25-26
• 2.2.3 相关溶液的配置26-27
• 2.2.4 实验仪器27
• 2.3 实验方法27-37
• 2.3.1 引物的设计与合成27-30
• 2.3.2 舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶催化区截短和催化区定点突变序列扩增30-33
• 2.3.3 重组表达载体构建33-37
• 2.4 实验结果37-42
• 2.4.1 舞毒蛾几丁质酶催化区截短载体构建37-39
• 2.4.2 舞毒蛾几丁质酶催化区定点突变载体构建39-42
• 2.5 讨论42-44
• 第三章 舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶催化区截短及突变在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达及纯化44-66
• 3.1 引言44-45
• 3.2 实验材料45-48
• 3.2.1 实验菌株及细胞45
• 3.2.2 实验试剂45-46
• 3.2.3 相关溶液的配置46-48
• 3.2.4 实验仪器48
• 3.3 实验方法48-57
• 3.3.1 重组截短、突变型舞毒蛾几丁质酶基因真核表达载体的重组构建48-51
• 3.3.2 细胞培养51-52
• 3.3.3 蛋白表达52-56
• 3.3.4 蛋白纯化56-57
• 3.4 实验结果57-64
• 3.4.1 四种舞毒蛾几丁质酶催化区截短Bac to Bac系统蛋白表达57-61
• 3.4.2 六种舞毒蛾几丁质酶催化区定点突变Bac to Bac系统蛋白表达61-64
• 3.5 讨论64-66
• 第四章 舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶催化区活性位点D143、D145的酶学活性研究66-78
• 4.1 引言66
• 4.2 实验材料66-67
• 4.2.1 实验试剂66-67
• 4.2.2 实验仪器67
• 4.3 实验方法67-69
• 4.3.1 蛋白标准浓度曲线的绘制67-68
• 4.3.2 蛋白样品浓度测定68
• 4.3.3 几丁质酶活测定68
• 4.3.4 最适pH和最适温度68-69
• 4.3.5 pH稳定性和热稳定性69
• 4.4 实验结果69-75
• 4.4.1 蛋白标准浓度曲线69-70
• 4.4.2 舞毒蛾几丁质酶催化区截短型和突变型几丁质酶活的分析70-71
• 4.4.3 舞毒蛾几丁质酶催化区突变型几丁质酶最适pH分析71-72
• 4.4.4 舞毒蛾几丁质酶催化区突变型几丁质酶最适温度的分析72-73
• 4.4.5 pH稳定性对舞毒蛾几丁质酶催化区突变型酶相对活性的影响73-74
• 4.4.6 热稳定性对舞毒蛾几丁质酶催化区突变型酶相对活性的影响74-75
• 4.5 讨论75-78
• 第五章 结论78-80
• 参考文献80-84
• 致谢84-86
• 攻读硕士学位期间发表的论文及专利86

【参考文献】

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本文编号：365184