褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）Trx1，TRP14 和Prx1基因的克

发布时间：2017-05-17 12:15

  本文关键词：褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）Trx1，TRP14 和Prx1基因的克隆、表达和转录水平的免疫刺激反应，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种非常珍贵的经济鱼类,随着养殖规模的扩大化,养殖中面临的鱼类疾病感染问题愈发严峻。为了更好地找到解决问题的办法,了解鱼类的免疫机制是很必要的。本文主要是研究了三个褐牙鲆抗氧化相关基因硫氧还蛋白1基因(thioredoxin 1, PoTrx1)、硫氧还蛋白相关蛋白14 (thioredoxin related protein 14, PoTRP14)和过氧化物酶基因1 (Peroxidase 1, PoPrx1)基因的基因序列信息和各组织、不同发育时期的表达差异,以及在接受免疫刺激的条件下,表达模式会有何变化。本研究采用RACE (Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆得到PoTrx1、PoTRP14基因的cDNA全长,并运用各种生物信息学软件对序列信息进行分析和预测,预测了所编码相关蛋白的基本信息、进行了物种间同源性的分析,并构建了各物种间的进化树。RT-PCR法分析了PoTrx1、PoTRP14基因在成体鱼八个不同组织和十四个不同胚胎发育时期的表达差异。同时建立了褐牙鲆肝脏细胞原代培养系统,分别用LPS、CuSO4和H202刺激肝脏细胞,然后用RT-PCR法分析免疫刺激前后PoTrx1、PoTRP14和PoPrx1基因的表达模式有何变化。研究成果作如下分述：1、PoTrx1基因全长cDNA的克隆和表达分析运用RACE技术克隆得到PoTrx1基因cDNA全长为723bp,其中包括366bp的开放阅读框(ORF)、324bp的3’-UTR和33bp的5’.UTR。预测该基因可编码121个氨基酸,理论分子量为15.90kDa,理论等电点为5.39。ORF中具有Trxl基因典型的保守区CGPC。同时分析了Trx1在不同物种之间的相似性,其中PoTrx1同半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)和松江鲈(Trachidermus fasciatus)的一致度分别为：60%、67%和61%。RT-PCR法检测显示PoTrx1在成体鱼八个组织中都有表达,尤其在小肠中的表达量最高,其次为肾脏、心脏、肝脏、脑和鳃,在肌肉组织中的表达量最低。组织表达的差异中,PoTrxl基因在免疫相关器官中的表达较高,这与Trx1执行的免疫功能相关。同时检测了PoTrx1基因在14个胚胎不同发育时期的表达情况,各发育时期的表达量有显著的差异,PoTrx1在未受精卵时期就已经开始表达,然而从1细胞期开始直到囊胚期的表达量都是相对稳定的低表达量,从神经胚期开始,表达量剧增,在体节期达到高峰,出膜期以及出膜一天表达量开始下降。建立褐牙鲆肝脏细胞原代培养系统,选用LPS、CuSO4和H2O2三组刺激物刺激肝脏细胞,PoTrx1的表达出现了显著的上调。LPS刺激之后,6h之后达到一个表达的高峰,随后在24h之后又出现的新的表达高峰；CuSO4刺激之后2h后迅速达到高峰,随后降低,维持一个较低的表达水平,在48h又出现了新的表达高峰；H2O2刺激组则是在12h和24h出现了明显的表达高峰。免疫刺激之后,PoTrx1表达量的上调说明Trx1基因功能同机体的免疫和抗氧化密不可分。2.PoTRP14基因全长cDNA的克隆和表达分析PoTRP14基因cDNA序列全长为909bp,其中包括58bp的5’-UTR区和479bp的3’-UTR区,预测372bp的ORF区可编码123个氨基酸,理论分子量和理论等电点分别为14.01kDa和5.70。ORF区具有TRPl4基因共有的CPDC保守序列。PoTRP14同裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)、大西洋鲑(Salmo salar)和点带石斑鱼(Epinephelus coioides)的一致度均为87%,同松江鲈(Trachidermus fasciatus)的一致度为86%。经RT-PCR检测分析,PoTRP14在各组织中都有表达,小肠中的表达量最高,其次为肾脏、心脏、肝脏、脑和鳃,在脾脏组织中的表达量最低。PoTRP14基因在不同胚胎发育时期的表达总体维持着较高的表达量,在未受精卵中有较高的表达量,随后的几个时期表达量相对稳定,高囊胚期相对低,在出膜前表达量出现一个急剧增长的表达高峰,随后急剧下降。PoTRP14基因在免疫刺激后肝脏细胞中的表达亦出现明显的上调,PoTRP14基因在LPS刺激后的6h和48h分别出现表达高峰；CuSO4刺激的2h和48h出现表达高峰,明显高于其他实验组；H2O2刺激后的12h和48h有表达高峰。3.PoPrx1基因全长cDNA的克隆和表达分析在免疫刺激实验中,PoPrx1基因的表达变化总体上是上调趋势。LPS刺激肝脏细胞后,PoPrx1基因的表达在6h和24h分别出现表达高峰；CuSO4刺激之后,2h和48h出现表达高峰；H202刺激组则是在12h和48h有表达高峰。本文所研究的三个抗氧化相关基因PoPrx1和PoTrx1、PoTRP14表达模式变化趋势大同小异,说明这三个基因在执行免疫防御功能和抗氧化机制上具有相似的特点。
【关键词】：褐牙鲆 PoTrx1 PoTRP14 PoPrx1 抗氧化 免疫刺激
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-15
• 第一章 文献综述15-33
• 第一节 鱼类免疫系统研究概述16-17
• 第二节 鱼类抗氧化机制研究概述17-21
• 第三节 硫氧还蛋白基因研究进展21-26
• 1.3.1 硫氧还蛋白的研究进展21-24
• 1.3.2 硫氧还蛋白基因家族的生物学功能24-26
• 第四节 硫氧还蛋白相关蛋白TRP14的研究进展26-27
• 第五节 硫氧还蛋白过氧化物酶Prx的研究进展27-29
• 第六节 鱼类细胞培养研究进展29-31
• 第七节 本论文研究的方法、意义31-33
• 1.7.1 本研究的方法31-32
• 1.7.2 本研究的意义32-33
• 第二章 PoTrx1和PoTRP14基因的克隆33-57
• 2.1 引言33
• 2.2 材料方法33-47
• 2.2.1 实验材料33-36
• 2.2.1.1 实验动物和取材33-34
• 2.2.1.2 实验试剂和药品34
• 2.2.1.3 实验仪器设备34-35
• 2.2.1.4 主要试剂及配置方法35-36
• 2.2.2 实验中的引物36-37
• 2.2.3 总RNA的提取和纯化37-39
• 2.2.3.1 总RNA的提取37-38
• 2.2.3.2 总RNA的纯化38-39
• 2.2.4 cDNA第一链的合成39-40
• 2.2.5 PoTrx1基因和PoTRP14基因核心片段的获得40-42
• 2.2.5.1 PoTrx1基因和PoTRP14基因核心片段的克隆40
• 2.2.5.2 PCR产物的回收和纯化40-41
• 2.2.5.3 连接反应41
• 2.2.5.4 感受态细胞的制备(氯化钙法)41-42
• 2.2.5.5 连接产物的转化和阳性克隆的筛选42
• 2.2.6 PoTrx1基因和PoTRP14基因3’UTR片段的获得42-45
• 2.2.6.1 3’cDNA的合成44
• 2.2.6.2 3’RACE半巢式PCR44-45
• 2.2.7 PoTrx1基因和PoTRPl4基因5'UTR片段的获得45-47
• 2.2.7.1 5’cDNA的合成46
• 2.2.7.2 5’RACE半巢式PCR46-47
• 2.2.8 PoTrx1基因和PoTRP14基因的序列分析、同源比对和进化树构建47
• 2.3 实验结果47-55
• 2.3.1 总RNA的提取47-48
• 2.3.2 PoTrx1和PoTRP14基因全长cDNA序列的获得48-50
• 2.3.3 PoTrx1和PoTRP14基因同源性分析50-53
• 2.3.4 PoTrx1和PoTRP14基因进化树的构建53-55
• 2.4 讨论55-57
• 第三章 PoTrx1和PoTRP14基因表达分析57-71
• 3.1 引言57
• 3.2 实验方法57-62
• 3.2.1 cDNA制备57-58
• 3.2.2 实时荧光定量Real-time PCR58-60
• 3.2.2.1 RT-PCR实验简介58-59
• 3.2.2.2 RT-PCR反应步骤59-60
• 3.2.2.3 数据处理60
• 3.2.3 免疫刺激后PoTrx1基因和PoTRP14基因的表达模式60-62
• 3.2.3.1 褐牙鲆肝脏原代细胞培养系统的建立(酶消化法)60-61
• 3.2.3.2 LPS、CuSO_4和H_2O_2刺激褐牙鲆肝细胞61
• 3.2.3.3 mRNA的提取和反转录61
• 3.2.3.4 LPS、CuSO_4和H_2O_2刺激褐牙鲆肝脏细胞后PoTrx1基因和PoTRP14基因的表达模式61-62
• 3.3 实验结果62-67
• 3.3.1 PoTrx1的组织差异性表达62-63
• 3.3.2 PoTRP14的组织差异性表达63
• 3.3.3 PoTrx1不同发育时期表达差异63-64
• 3.3.4 PoTRP14不同发育时期表达差异64-65
• 3.3.5 免疫刺激前后PoTrx1基因的表达模式65-66
• 3.3.6 免疫刺激前后PoTRP14基因的表达模式66-67
• 3.4 讨论67-71
• 第四章 PoPrx1基因免疫刺激后表达模式71-74
• 4.1 引言71
• 4.2 实验方法71-72
• 4.2.1 mRNA的提取和反转录71
• 4.2.2 LPS、CuSO_4和H_2O_2刺激褐牙鲆肝脏细胞后PoPrx1基因表达模式71-72
• 4.3 实验结果72-73
• 4.4 讨论73-74
• 参考文献74-83
• 致谢83-84
• 个人简历84-85
• 在学期间发表的学术论文与研究成果85

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