细胞硫氧还蛋白2与猪瘟病毒E2蛋白的相互作用及其对猪瘟病毒复制的调控作用

发布时间：2017-05-23 07:25

  本文关键词：细胞硫氧还蛋白2与猪瘟病毒E2蛋白的相互作用及其对猪瘟病毒复制的调控作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪瘟(classical swine fever,CSF)被世界动物卫生组织(OIE)列为必须上报的动物烈性传染病之一,临床上以高热稽留、高死亡率、免疫抑制和繁殖障碍为主要特征。CSF的病原是猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)。CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员,该属还包括牛病毒性腹泻病病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、绵羊边界病病毒(border disease virus,BDV)等成员。CSFV的结构蛋白包括囊膜糖蛋白Erns、E1、E2和衣壳蛋白C。E2是CSFV重要的毒力因子和主要的保护性抗原,同时在病毒的吸附和侵入过程中发挥重要作用。但迄今为止有关E2蛋白与宿主细胞相互作用的研究很少。本研究利用猪巨噬细胞cDNA酵母表达文库和酵母双杂交技术筛选与E2蛋白存在相互作用的宿主蛋白,获得了17种与E2可能存在相互作用的宿主蛋白,经比较分析后选择硫氧还蛋白2(thioredoxin 2,Trx2)进行深入研究。Trx2广泛表达于猪的不同组织中。经酵母共转化验证、GST pull-down试验和原位邻位连接试验(in situ proximity ligation assay,PLA)证明,Trx2蛋白和CSFV E2蛋白存在直接的相互作用。激光共聚焦试验证明,E2蛋白与Trx2蛋白共定位于胞浆。通过Trx2蛋白的三种截短突变体与E2蛋白的GST pull-down试验结果表明,Trx2蛋白的硫氧还结构域是其与E2蛋白相互作用的关键区域。为研究Trx2蛋白对CSFV复制的调控作用,我们设计并合成特异性靶向Trx2蛋白的干扰性小RNA分子,通过RNA干扰下调PK-15细胞内源性Trx2蛋白的表达,结果表明,沉默Trx2蛋白可显著促进CSFV的增殖和基因组的复制;将CSFV感染慢病毒介导的稳定表达Trx2蛋白的PK-15细胞系,结果显示,过表达Trx2蛋白后会显著抑制CSFV的增殖和基因组的复制。在CSFV感染后不同时间点利用Western blotting检测细胞内Trx2蛋白的表达情况,发现CSFV感染的PK-15细胞中Trx2蛋白表达量明显低于对照组;用E2和Trx2表达质粒共转染HEK293T细胞,结果显示,Trx2蛋白的表达量随E2蛋白表达量的增加而减少,这表明,CSFV感染能抑制Trx2蛋白的表达。总之,本研究确定了Trx2蛋白与E2蛋白的相互作用及其关键区域,证实了Trx2蛋白对CSFV复制的抑制作用,有助于增进我们对CSFV感染机制的理解。
【关键词】：猪瘟病毒 囊膜糖蛋白E2 硫氧还蛋白2 病毒-宿主相互作用 病毒复制的调控
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 猪瘟病毒11-15
• 1.1.1 猪瘟病毒11
• 1.1.2 猪瘟病毒囊膜糖蛋白的结构和功能11-12
• 1.1.3 猪瘟病毒与宿主相互作用研究进展12-15
• 1.2 硫氧还蛋白 215-16
• 1.2.1 硫氧还蛋白2的结构15
• 1.2.2 硫氧还蛋白2的功能15-16
• 1.3 研究的目的和意义16-18
• 第二章 Trx2蛋白与CSFV E2蛋白的相互作用及其对CSFV复制的调控作用18-37
• 2.1 材料与方法18-26
• 2.1.1 细胞、毒株、菌株和载体18
• 2.1.2 主要试剂18
• 2.1.3 基因扩增与克隆18-20
• 2.1.4 酵母双杂交筛选与CSFV E2相互作用的宿主蛋白20-21
• 2.1.5 猪体各组织中 Trx2 蛋白表达丰度的检测21
• 2.1.6 Trx2 与 CSFV E2 的酵母共转化验证21
• 2.1.7 Trx2 的原核表达及纯化21-22
• 2.1.8 细胞转染及真核表达22
• 2.1.9 GST pull-down 试验22
• 2.1.10 原位邻位连接试验22-23
• 2.1.11 激光共聚焦试验23
• 2.1.12 RNA 干扰试验23-24
• 2.1.13 Trx2 稳定表达 PK-15 细胞系的构建24
• 2.1.14 过表达 Trx2 对 CSFV 复制的影响24
• 2.1.15 CSFV 感染对 Trx2 表达的影响24-25
• 2.1.16 Western blotting25
• 2.1.17 荧光定量 RT-PCR25
• 2.1.18 间接免疫荧光试验25-26
• 2.1.19 统计学分析26
• 2.2 结果26-35
• 2.2.1 酵母双杂交筛选与E2相互作用的蛋白26
• 2.2.2 酵母共转化验证Trx2与CSFV E2的相互作用26-27
• 2.2.3 GST pull-down试验验证Trx2与CSFV E2的相互作用27
• 2.2.4 原位邻位连接试验验证Trx2与CSFV E2的相互作用27-28
• 2.2.5 激光共聚焦试验验证Trx2与CSFV E2的相互作用28-29
• 2.2.6 硫氧还结构域是Trx2与CSFV E2相互作用的关键区域29-30
• 2.2.7 沉默Trx2促进CSFV的增殖30-31
• 2.2.8 过表达Trx2抑制CSFV的增殖31-32
• 2.2.9 CSFV感染下调Trx2的表达32-33
• 2.2.10 CSFV 感染下调 Trx2 的表达33-34
• 2.2.11 CSFV E2 蛋白剂量依赖性地抑制 Trx2 蛋白的表达34-35
• 2.3 讨论35-37
• 第三章 全文结论37-38
• 参考文献38-46
• 致谢46-47
• 作者简历47

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