猪源附红细胞体分离鉴定PCR方法的建立及小附红细胞体人工感染试验

发布时间：2017-05-24 06:17

  本文关键词：猪源附红细胞体分离鉴定PCR方法的建立及小附红细胞体人工感染试验，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：感染猪的附红细胞体分为附红细胞体和小附红细胞体两大类。而国内还未见有关小附红细胞体分离和动物感染试验的报道。通过小附红细胞体病原的分离鉴定及动物感染试验,有助于了解小附红细胞体的生物学特性及致病性。本试验从上海地区2个屠宰场,采集猪抗凝血736份,提取血液基因组DNA作为模板,设计合成两对特异性引物并验证了具有高度敏感性和良好特异性,用两对特异性的引物进行16s RNA基因部分序列的PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果显示,在736份血样中,猪源附红细胞体阳性率为13.72%(101/756),其中小附红细胞体阳性率为7.34%(54/736),猪附红细胞体阳性率为4.76%(35/736),混合感染比例为1.63%(12/736),2个屠宰场3次采集的样品阳性率差异极显著(χ2==132.841,P0.001)。嘉定区某屠宰场3月份的阳性率为2.41%,5月份的阳性率为33.21%,5月份极显著高于3月份(χ2=81.484,P0.001)。在DNA扩增阳性血样中,分别选取4份小附红细胞体引物扩增产物和4份猪附红细胞体引物扩增产物,亚克隆到pMD18-T载体后进行测序。小附红细胞体扩增片段序列完全一致,长度均为483 bp, BLASTn软件在线分析显示所获得序列与GenBank公布的小附红细胞体Indiana株16S rRNA基因(登录号：NR 121759)序列同源性达100%。猪附红细胞体扩增片段序列也完全一致,长度均为482 bp, BLASTn软件在线分析显示所获得序列与GenBank公布的猪附红细胞体Morioka5、6、8株16SrRNA基因(登录号分别为：AB610847、AB610848、AB610849)和ZJ NB01株16S rRNA基因(登录号：KC907396.1)序列同源性达100%,猪附红细胞体扩增片段与小附红细胞体扩增片段的同源性仅为93.6%。用小附红细胞体阳性血样通过肌肉注射方法接种广西巴马去脾仔猪,采集血样进行特异性PCR检测及序列分析。结果表明：试验组5头仔猪中有2头在接种12d、5头在接种15d均检出小附红细胞体基因,人工感染猪血样与接种原血样DNA扩增产物基因序列完全一致。这证明已经成功建立了小附红细胞体人工感染猪的试验。本研究通过试验数据证明了国内确实有猪感染小附红细胞体,小附红细胞体和猪附红细胞体在16sRNA基因片段上存在差异。通过人工肌肉接种,首次建立了小附红细胞体猪感染试验模型,为小附红细胞体的生物学特性和致病性研究打下了基础。
【关键词】：猪源附红细胞体 小附红细胞体 猪附红细胞体 16sRNA基因 特异性PCR
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文缩略表7-11
• 第一章 文献综述11-22
• 1 猪源附红细胞体病原学研究进展11-14
• 1.1 病原分类11-12
• 1.2 病原形态及分布12-13
• 1.3 增殖13-14
• 2 猪附红细胞体流行病学研究概述14
• 3 附红细胞体病诊断手段的研究进展14-20
• 3.1 形态学诊断14
• 3.2 血清学诊断14-17
• 3.3 分子生物学检测17-20
• 4 小附红细胞体的研究概述20
• 5 研究目的意义20-22
• 第二章 猪源附红细胞体PCR检测方法的建立22-29
• 1 实验材料22-23
• 1.1 阳性质粒DNA22
• 1.2 酶及试剂22
• 1.3 主要仪器22-23
• 2 实验方法23-24
• 2.1 特异性引物设计23
• 2.2 特异性试验23
• 2.3 敏感性试验23-24
• 3 试验结果24-27
• 3.1 特异性试验24-25
• 3.2 敏感性试验25-27
• 4 讨论27-28
• 5 小结28-29
• 第三章 上海地区猪源附红细胞体流行病学调查29-41
• 1 实验材料29-31
• 1.1 猪血液样品29
• 1.2 主要药品及试剂29-31
• 1.3 主要器材31
• 2 实验方法31-34
• 2.1 提取猪全血基因组DNA31-32
• 2.2 两种猪源附红细胞体的特异基因扩增32-33
• 2.3 两种猪源附红细胞体引物扩增阳性产物的纯化(胶回收)33
• 2.4 两种猪源附红细胞体16S rRNA部分目的基因克隆33-34
• 2.5 两种猪源附红细胞体16SrRNA目的基因的鉴定(菌液PCR)34
• 3 结果34-39
• 3.1 两种猪源附红细胞体16SrRNA的特异性引物扩增结果34-35
• 3.2 两种猪源附红细胞体16SrRNA的目的基因的鉴定35-36
• 3.3 测序结果及NCBI在线BLASR比对36-38
• 3.4 上海地区猪源附红细胞体流行病学调查结果38-39
• 4 讨论39-40
• 5 小结40-41
• 第四章 小附红细胞体人工感染猪模型初步建立41-50
• 1 实验材料41-43
• 1.1 猪小附红细胞体阳性血液样品制备41
• 1.2 实验动物41
• 1.3 主要试剂41-42
• 1.4 主要仪器42-43
• 2 试验方法43-44
• 2.1 预试验43
• 2.2 试验动物分组及处理43
• 2.3 检测指标43-44
• 2.4 血液基因组的提取44
• 2.5 PCR检测44
• 3 试验结果44-48
• 3.1 临床症状44
• 3.2 姬姆萨染色结果44-46
• 3.3 血液PCR检测46-48
• 4 讨论48-50
• 全文结论50-51
• 本实验的创新点51-52
• 参考文献52-58
• 致谢58-59
• 攻读硕士学位期间发表的论文59

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本文编号：390005