利用VIGS技术对草莓FaMYB5基因功能的研究

发布时间：2017-05-24 16:21

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【摘要】：病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制,属于转录后水平的基因沉默现象。是目前开发的一种反向遗传学新技术,在动植物功能基因组学研究方面得到广泛应用。类黄酮化合物(Flavonids)是植物重要的次生代谢产物之一,在植物界中分布广泛且具有较强的生物活性,不仅有益人类身体健康还影响植物花器官发育和果实着色等。草莓(Fragaria×ananassa. Duch.)属蔷薇科草莓属多年生草本植物,其果实含高浓度的类黄酮化合物,具有重要的保健功能和显著的经济效益,因此倍受消费者和种植者的喜爱。目前,草莓类黄酮化合物代谢途径中主要结构基因已被认知,但是该途径的转录调控信息却知之甚少。大量研究表明,类黄酮化合物花青素苷、原花青素等代谢途径均受MYB转录因子调控。因此利用VIGS技术快速鉴定黄酮化合物代谢相关转录因子的功能,揭示在转录水平上对草莓黄酮类物质代谢途径的调控机理,对改善草莓的品质,以及其他园艺作物的遗传改良,具有重要的理论和实际意义。本研究以草莓‘丰香’(Fragaria× ananassa cv. Toyonaka)为材料。利用VIGS技术对草莓果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子FaMYB5基因进行沉默,并对该基因沉默后类黄酮化合物途径相关基因表达量进行分析,同时对沉默后果实中花青素苷和原花青素的含量进行测定,以期全面探明草莓中FaMYB5基因对类黄酮化合物代谢途径的调控作用及其机制,揭示其功能。主要得到以下研究结果：1采用改良的CTAB法提取草莓不同组织及果实不同发育时期的总RNA,并反转录成cDNA。根据GenBank中已登录的森林草莓MYB5基因序列(JQ989280.1),同源克隆FaMYB5基因全长编码序列(Full Coding Sequences, CDS);序列分析表明：该基因CDS区共832bp,编码273个氨基酸,与森林草莓的MYB5同源性达97%。其蛋白结构中缺少R2结构域,因此FaMYB5转录因子更类似R3类MYB转录因子,并且其R3重复单元中存在与bHLH因子互作作用相关的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R序列。2采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测FaMYB5在果实不同发育时期的基因表达情况。研究结果表明：FaMYB5基因在草莓果实发育的6个时期均有表达,其表达量存在差异。从整体趋势看,随着果实发育成熟,FaMYB5基因的表达是逐渐上升的。在果实的小绿期(SG), FaMYB5基因的表达量最低。但是在白果期(Vhite)出现一个降低的峰值,其表达量略高于小绿期,之后草莓果实开始转红时其表达量又逐渐上升,在果实全红期(FR)达到最大,说明FaMYB5与类黄酮化合物代谢有关。3构建VIGS载体pTRV-FaMYB5,通过注射法侵染草莓果实,导致果实内源FaMYB5基因沉默建立草莓VIGS体系。观察FaMYB5沉默后‘丰香’草莓果实的表观变化,采用半定量RT-PCR和qRT-PCR的方法检测FaMYB5基因的沉默效率,结果显示FaMYBS基因沉默效率达60%,成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS重组载体及草莓VIGS体系。4采用半定量RT-PCR和qRT-PCR测定FaMYB5沉默后草莓类黄酮化合物代谢途径相关基因的表达量,同时分别采用HPLC和DMACA化学反应法对FaMYB5沉默后果实中的花青素苷和原花青素进行测定。结果表明：该基因沉默后,FaANS的表达量及花青素苷含量降低,而FaLAR、FaANR和FaMYB9表达量均增加,从而导致果实中原花青素含量增加。综合分析表明：FaMYB5是通过与FaMYB9转录因子竞争bHLH3蛋白结合的结合位点,从而抑制TTGI-FaMYB9-bHLH3三元复合体的活性,间接调控FaLAR/FaANR基因的表达。从分子和生理两方面的研究表明：FaMYB5转录因子是草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径中的负调控因子。5研究发现FaMYB5基因沉默后FabHLH3、bHLH3△基因的表达量减少,说明它们之间存在抑制关系。Burr认为由于FabHLH3△和FaMYB5有相互作用,两者是否相互抑制还需进一步研究。另外FaMYB5基因沉默也引起了FaGL3基因表达量的增加,但aANS的表达量却下降,这与Jan G. Schaart推断的FaGL3转录因子可能促进FaANS的表达截然不同,所以FaGL3是否与FaTTG1和FaMYB 10结合形成MBW三元复合体,形成的三元符合体是否调节FaANS还需要进一步研究。
【关键词】：VIGS 草莓 FaMYB5 类黄酮
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S668.4
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 缩写词表12-13
• 第一章 课题提出与前人研究进展13-22
• 1 课题提出13-14
• 2 VIGS的研究进展14-18
• 2.1 VIGS的发现14
• 2.2 VIGS的作用机制14-16
• 2.2.1 起始阶段14-15
• 2.2.2 维持阶段15
• 2.2.3 信号放大与传播15-16
• 2.3 VIGS载体16-17
• 2.4 VIGS在植物基因功能研究上的应用17-18
• 3 植物转录因子概念及分类18-20
• 3.1 MY-B转录因子的结构特征18-19
• 3.2 FaMYB5转录因子的发现19
• 3.3 FaMYB5的功能研究19-20
• 4 本课题的目标与意义20-22
• 第二章 草莓FAMYB5基因的克隆序列分析及表达22-36
• 1 材料与方法22-29
• 1.1 供试材料22-23
• 1.2 试剂和试剂盒23
• 1.3 工程菌株23
• 1.4 载体23-24
• 1.5 实验方法24-29
• 1.5.1 总RNA提取及检测24
• 1.5.2 cDNA合成24-25
• 1.5.3 引物的设计与片段扩增25-26
• 1.5.4 PCR产物回收26
• 1.5.5 感受态细胞制备26-27
• 1.5.6 产物与载体的连接、转化及测序后数据分析27
• 1.5.7 半定量RT-PCR检测基因表达水平27-28
• 1.5.8 qRT-PCR检测基因表达水平28-29
• 2 结果与分析29-35
• 2.1 草莓6个不同发育时期总RNA的提取29-30
• 2.2 FaMYB5的全长编码区扩增和基因序列分析30-31
• 2.3 FaMYB5转录因子的结构分析31-34
• 2.3.1 FaMYB5功能相近转录因子的系统发育分析33
• 2.3.2 FaMYB5的三级结构预测33-34
• 2.4 FaMYB5基因在草莓果实发育过程中的表达34-35
• 3 讨论35-36
• 第三章 草莓果实VIGS体系的建立36-46
• 1 材料与试剂36-38
• 1.1 材料36
• 1.2 菌株与质粒36-37
• 1.3 酶及试剂37-38
• 2 方法38-42
• 2.1 FaMYB5基因特异性扩增及PCR产物回收38
• 2.2 酶切38
• 2.3 酶切产物及载体回收38-39
• 2.4 目的基因与载体连接39
• 2.5 大肠杆菌转化39
• 2.6 质粒提取及鉴定39-40
• 2.7 农杆菌感受态的制备40
• 2.8 转化农杆菌40
• 2.9 农杆菌侵染40-41
• 2.10 草莓中FaMYB5基因沉默分析41-42
• 2.10.1 病毒检测41
• 2.10.2 FaMYB5基因沉默的分子水平分析41-42
• 3 结果与分析42-44
• 3.1 VIGS载体构建42
• 3.2 草莓VIGS体系的建立42-43
• 3.3 病毒的分子检测43
• 3.4 半定量和qRT-PCR技术对FaMYB5基因沉默效率的检测43-44
• 4 讨论44-46
• 第四章 FAMYB5基因沉默后类黄酮化合物代谢途径相关基因和花青素苷及原花青素的变化46-58
• 1 材料与方法48-52
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-52
• 1.2.1 草莓FaMYB5沉默果实及阴性对照果实总RNA的提取48
• 1.2.2 类黄酮化合物代谢相关基因的引物设计与合成48-50
• 1.2.3 FaMYB5沉默后类黄酮代谢相关基因的半定量和qRT-PCR表达50-51
• 1.2.4 果实中花青素的提取和测定51
• 1.2.5 比色法测定FaMYB5沉默后草莓果实原花青素的总含量51-52
• 1.2.6 数据分析52
• 2 结果与分析52-54
• 2.1 果实中FaMYB5基因沉默后类黄酮化合物代谢途径相关基因的变化52-53
• 2.2 果实中FaMYB5基因沉默后花青素的代谢变化53-54
• 2.3 果实中FaMYB5基因沉默后原花青素的代谢变化54
• 3 讨论54-58
• 第五章 需要进一步研究的内容58-60
• 参考文献60-71
• 附录71-74
• 1、主要试剂配制71-73
• 2、主要使用仪器73-74
• 致谢74

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本文编号：391333