FoxO1调控鹅原代肝细胞脂质代谢作用研究

发布时间：2017-06-03 06:13

  本文关键词：FoxO1调控鹅原代肝细胞脂质代谢作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的：肝脏在维持机体糖脂代谢平衡中起重要作用。近年来,叉头框蛋白1(F oxO1)成为研究胰岛素抵抗,肥胖以及2型糖尿病的热点基因,暗示其在脂质代谢中存在作用。本实验以鹅原代肝细胞为实验材料,通过转染FoxO1干扰质粒,添加胰岛素以及NVP-BEZ235处理鹅肝细胞,采用荧光定量PCR法、western blot蛋白检测法,Elisa试剂盒检测法以及油红O染色法检测脂肪酸合成,VLDL-TG分泌转运以及脂肪酸氧化途径的相关指标来反映脂质代谢的变化,分析胰岛素通过FoxO1调控鹅肝细胞脂质代谢的作用,探讨FoxO1对肝脏脂质代谢的作用是否是由PI3K-Akt信号通路介导的,以期进一步阐明转录因子FoxO1在鹅肝脏脂质代谢过程中的作用,为探讨胰岛素、PI3K-Akt信号通路以及FoxO1在肝脏内脂质代谢作用的分子机制及其对基因水平的调控作用提供理论依据。结果：1、转染pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR-FoxO1质粒24小时后细胞内总FoxO1蛋白含量显著下调,荧光定量PCR检测显示FoxO1干扰效率达51.2%,表明干扰FoxO1表达成功。2、胰岛素处理肝细胞使FoxO1磷酸化增加,mRNA表达量减少进而其活性降低,相反NVP-BEZ235处理使FoxO1基因mRNA表达量和蛋白表达量增加(P0.05),表明胰岛素能抑制FoxO1活性而NVP-BEZ235使FoxO1活性增加。3、FoxO1干扰能显著降低Akt的mRNA的表达水平,而增加mTORc1的mRNA表达水平(P0.05)；western blot检测结果显示FoxO1干扰能降低Akt的磷酸化水平,增加mTORc1的蛋白表达,表明FoxO1能调节Akt和mTORc1基因的表达。4、鹅肝细胞转染FoxO1干扰质粒后,FAS、ACCα、CPT1、ACOX1、MTP、ApoB基因mRNA表达量和激酶表达量于对照组显著减少(P0.05),DGAT1表达量增加,其中,SREBP1、DGAT2、PPARa和PPARy基因mRNA表达量与对照组无明显差异(P0.05)。Western blot检测ACCα、CPT1、MTP蛋白含量显示,FoxO1干扰后ACCα和MTP蛋白表达水平明显低于对照组,CPT1则无显著变化。油红O染色显示鹅肝细胞干扰FoxO1使细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时细胞内外TG含量增加,而胞外VLDL含量减少。5、胰岛素处理鹅肝细胞后CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARa和PPARy基因m RNA表达量降低,同时增加了ACCaα、FAS、SREBP1、DGAT1和DGAT1基因的表达,同时western blot和Elisa检测CPT1和MTP均显示出与mRNA表达水平类似的结果。同时,油红O染色发现细胞内脂滴增多。另外,在胰岛素处理肝细胞后转染FoxO1干扰质粒,发现CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、PPARa和PPARγ基因m RNA表达量也显著低于对照组且比单独的胰岛素处理更为明显(P0.05),然而,S REBP1和DGAT1的表达量增加,ACCa和FAS基因的mRNA表达量则与对照组无显著差异；此外,检测细胞内外TG含量发现均高于对照组,而细胞外VLDL含量减少；同时油红O染色发现细胞脂滴颗粒增多,脂质沉积增加。6、鹅肝细胞经过NVP-BEZ235处理阻断PI3K-Akt-mTORc1信号通路后,发现ACC α、FAS、SREBP1、DGAT1和DGAT1基因的表达量降低,CPT1、ACOX1、MTP、 ApoB、PPARa和PPARy基因mRNA表达量增加(P0.05)。油红O染色显示细胞内脂滴颗粒明显减少,同时细胞内外的TG含量减少,胞外VLDL含量增加。然而,在NVP-BEZ235处理阻断PI3K-Akt1-mTORc1信号通路后继续转染FoxO1干扰质粒,发现ACCα、FAS、SREBP1、DGAT1、DGAT2、CPT1、ACOX1、MTP、ApoB、P PARa和PPARy基因mRNA表达量均与对照组无显著变化,细胞内脂滴含量也趋于正常水平。
【关键词】：鹅肝原代细胞 FoxO1 PI3K-Akt通路 脂质代谢 胰岛素
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S835
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 常用词语英文缩写10-13
• 1 文献综述13-20
• 1.1 FoxO1概述13-14
• 1.2 FoxO1与胰岛素的关系14-15
• 1.3 FoxO1与PI3K-Akt-mTORc1通路的关系15-16
• 1.4 FoxO1与脂质代谢研究进展16-18
• 1.5 PI3K-Akt通路与脂质代谢18-19
• 1.6 本研究的目的及意义19-20
• 2 材料与方法20-34
• 2.1 试验材料20-23
• 2.1.1 试验样品20
• 2.1.2 主要药品和试剂20-23
• 2.1.3 主要仪器设备23
• 2.2 试验方法23-34
• 2.2.1 引物设计及合成23-24
• 2.2.2 细胞培养24-26
• 2.2.3 CCK-8试剂盒检测细胞活性26
• 2.2.4 脂滴油红O染色26-27
• 2.2.5 总RNA提取及质量检测27-28
• 2.2.6 反转录反应28-29
• 2.2.7 荧光定量PCR29-30
• 2.2.8 FAS、ACCα、CPT1、TG、VLDL酶活性检测30-31
• 2.2.9 Western Blot检测基因蛋白表达31-33
• 2.2.10 pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR-FoxO1甘油菌的扩繁、质粒抽提及鉴定33-34
• 2.2.11 试验数据分析34
• 3 试验结果34-61
• 3.1 鹅FoxO1基因miRNA干扰载体构建及筛选34-38
• 3.1.1 miRNA干扰载体的构建34-36
• 3.1.2 最佳干扰序列及干扰时间的筛选36-38
• 3.2 鹅肝细胞FoxO1干扰对PI3K-Akt-mTOR1信号途径及脂质代谢的影响38-43
• 3.2.1 FoxO1干扰对PI3K-Akt-mTORc1信号途径的影响38-39
• 3.2.2 FoxO1干扰对脂肪酸合成的影响39-41
• 3.2.3 鹅肝细胞FoxO1干扰对脂肪酸氧化的影响41-42
• 3.2.4 鹅肝细胞FoxO1干扰对VLDL-TG组装分泌的影响42-43
• 3.3 胰岛素和NVP-BEZ235对PI3K-AKT-mTORc1信号通路表达的影响43-44
• 3.4 胰岛素和NVP-BEZ235对FoxO1表达活性的影响44-46
• 3.4.1 胰岛素对FoxO1表达活性的影响44-45
• 3.4.2 NVP-BZE235抑制PI3K-Akt1-mTORc1信号通路对FoxO1的影响45-46
• 3.5 胰岛素通过FoxO1调节鹅肝细胞脂质代谢作用研究46-53
• 3.5.1 胰岛素处理并干扰FoxO1对脂肪酸合成的影响46-49
• 3.5.2 胰岛素处理并干扰FoxO1对肝细胞脂肪氧化基因表达的影响49-50
• 3.5.3 胰岛素处理并干扰FoxO1对肝细胞VLDL-TG组装分泌的影响50-53
• 3.6 PI3K-Akt-mTOR1信号途径通过FoxO1调控鹅肝细胞脂质代谢的作用研究53-61
• 3.6.1 NVP-BEZ235处理同时干扰FoxO1对脂肪酸合成影响53-57
• 3.6.2 NVP-BEZ235处理细胞同时干扰FoxO1对脂肪酸氧化基因表达的影响57-59
• 3.6.3 NVP-BEZ235处理细胞同时干扰FoxO1对VLDL-TG组装分泌的影响59-61
• 4 讨论61-66
• 4.1 转录因子FoxO1与PI3K-Akt信号通路的调控关系61-62
• 4.1.1 鹅肝细胞转录因子FoxO1对PI3K-Akt-mTORc1信号通路的影响61-62
• 4.1.2 PI3K-Akt-mTORc1信号通路调节FoxO1的活性62
• 4.2 转录因子FoxO1与脂质代谢关键途径的调控关系62-64
• 4.3 胰岛素通过FoxO1调控鹅肝细胞脂质代谢的机理分析64-65
• 4.4 PI3K-Akt通路通过FoxO1调控鹅肝细胞脂质代谢的机理分析65-66
• 5 结论66-67
• 参考文献67-73
• 致谢73-74
• 硕士研究生学习期间发表文章情况74

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1 杜荣,秦健,王俊东;动物脂质代谢调控的关键及其研究进展[J];动物科学与动物医学;2002年10期

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本文编号：417440