川芎COMT基因序列的克

发布时间：2017-06-03 12:16

  本文关键词：川芎COMT基因序列的克隆、分析、表达及功能鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)为我国中医传统药物中的一种常用药物,有活血行气、祛风止痛的功效。其中阿魏酸为其指标成分和主要活性成分。阿魏酸的生物合成途径中以咖啡酸甲基化生成阿魏酸为主要调控步骤,其中咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)在其中起着很重要的作用。从川芎转录组中筛选出了一条同源性较高的COMT序列。通过RACE技术扩增出序列的全长序列。序列全长1171bp,翻译362aa的蛋白,命名为C4-COMT (GenBank accession no.KR106206)。蛋白基本性质分析结果显示,C4-COMT蛋白分子量为39.932kDa,等电点为5.95。对其蛋白亲疏水、信号肽、亚细胞定位分析显示,蛋白为偏亲水性蛋白,无信号肽,亚细胞定位可能在细胞质。通过与其他8条已知COMT氨基酸序列进行序列比对分析,找到了COMT蛋白保守的7个基序,以及COMT催化的关键氨基酸残基。与其他49种物种已知的COMT一起构建进化树,聚类发现COMT在进化过程中趋于保守。其中川芎C4-COMT蛋白与同为伞形科植物的大阿米芹关系最近,归为一类,而与原核生物中的香蕉枯萎病菌关系最远。对序列的密码子偏好性进行了分析,发现序列的密码子偏好性与大肠杆菌的密码子偏好性差异不大。预测了蛋白二级结构同时根据同源建模法以紫花苜宿COMT为模板构建了蛋白的三维模型。通过PCR、双酶切、连接技术构建COMT-pET28a重组质粒,转化进BL21菌体中,构建重组菌株。重组菌株经IPTG诱导,成功表达了COMT重组蛋白。对重组菌株的表达条件进行优化,确定了重组菌株表达的最佳温度为37℃、最佳IPTG浓度为2mM、最佳表达时间4h。重组蛋白的可溶性研究发现重组蛋白可溶于水,说明蛋白未形成包涵体。采用Ni2+亲和柱层析分离纯化重组COMT蛋白,得到纯化后的COMT蛋白,并对蛋白的浓度进行了测定。在pH7,37℃的条件下,进行酶促反应,采用高效液相色谱检测酶活性。应用反相柱层析对反应产物进行纯化,纯化产物经1HNMR结构鉴定为阿魏酸。对酶的最适反应条件进行了研究,确定了重组COMT蛋白的最适温度和最适pH分别为37℃,pH7,为重组蛋白的体外应用打下了基础。对预测的关键氨基酸残基进行点突变研究,验证了参与COMT蛋白催化的关键氨基酸残基。
【关键词】：川芎 COMT 生物信息学分析 原核表达 酶活性 阿魏酸
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.239;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第1章 绪论9-24
• 1.1 川芎简介9-12
• 1.2 川芎的功效12-13
• 1.3 阿魏酸13-17
• 1.4 阿魏酸的生物合成途径17-19
• 1.5 咖啡酸-0-甲基转移酶19-22
• 1.6 课题的研究内容、技术路线及创新点22-24
• 第2章 川芎COMT基因的克隆及生物信息学分析24-45
• 2.1 材料与方法24-25
• 2.2 实验方法25-28
• 2.3 结果分析28-31
• 2.4 川芎COMT的生物信息学分析31-44
• 2.5 本章小结44-45
• 第3章 川芎COMT的原核表达及酶活鉴定45-65
• 3.1 实验材料45-46
• 3.2 实验方法46-52
• 3.3 结果与分析52-64
• 3.4 本章小结64-65
• 结论65-67
• 致谢67-68
• 参考文献68-76
• 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果76

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