日本结缕草ZjDREB2.2基因克隆及功能研究

发布时间：2017-06-06 16:10

  本文关键词：日本结缕草ZjDREB2.2基因克隆及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结缕草(ZoysiaWilld.)是一类多年生禾本科植物,具有发达的匍匐茎和根状茎,因具有抗干旱、耐践踏、抗盐碱、抗病虫害能力强等特点,所以成为我国主要的建坪草种之一。目前关于结缕草结缕草抗逆分子机制研究尚不深入。研究结缕草对逆境胁迫的分子响应特征,对结缕草的种植管理和育种研究有指导作用。已有研究表明DREB家族转录因子参与植物抗逆基因表达的调控,在植物逆境响应中起关键作用。本研究以日本结缕草'Meyer'为材料,获得了ZjDREB2.2的基因,是DREB类A-2家族成员,对其表达模式和基因功能进行了初步研究,结果如下：1. ZjDREB2.2有两个转录本,分别命名为ZjDREB2.2-S和ZjDREB2.2-L。ZjDREB2.2-L基因含有一个50bp的插入序列,导致了阅读框提前终止。ZjDREB2.2-S有完整的阅读框,推测编码338个氨基酸,编码的蛋白质分子量(MW)37297.6,等电点pI为4.86,第89-145位氨基酸构成一个典型的AP2结构域。ZjDREB2.2-S编码的蛋白属于DREB2组,与禾本科C4植物中的高粱、谷子的同源基因遗传距离较近。2.在正常生长条件下,结缕草叶中ZjDREB2.2-S、ZjDREB2.2-L均有表达,受12℃以下低温诱导上调表达,而对干旱和高盐胁迫响应不显著。在4℃低温下胁迫72h期间,根和匍匐茎中的ZjDREB2.2-S均上调表达。叶和匍匐茎中ZjDREB2.2-L的表达也受低温诱导,但在根中的表达受低温抑制。3.在酵母细胞中,GAL4BD-ZjDREB2.2-S融合基因可以与DRE元件特异结合并调节报告基因HIS3和LacZ基因的表达；GAL4BD-ZjDREB2.2-S融合基因表现出很强的转录激活活性。ZjDREB2.2-L没有这些活性。4.构建了35S启动子调控的ZjDREB2.2基因表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥。通过PCR筛选得到17株转化了ZjDREB2.2-S和1株转化了ZjDREB2.2-L的植株。转化ZjDREB2.2-S的植株具有矮化、生长缓慢和花期推迟的表型,而转化ZjDREB2.2-L植株生长表型与对照植株无明显差异。
【关键词】：结缕草 DREB 逆境响应模式 酵母单杂交 转基因
【学位授予单位】：中央民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S688.4
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文献综述10-19
• 1. 结缕草属植物抗逆研究进展10-14
• 1.1 结缕草形态特征和地理分布10-11
• 1.2 结缕草的抗寒性11-12
• 1.3 结缕草的耐盐性12-13
• 1.4 结缕草的耐旱性13-14
• 1.5 结缕草抗逆育种研究14
• 2. 植物转录因子DREB研究14-17
• 2.1 DREB转录因子分子特征15-16
• 2.2 DREB的基因结构同源性及多样性16
• 2.3 DREB与植物抗逆育种16-17
• 3. 本研究思路、目的及意义17-19
• 第二章 日本结缕草ZjDREB2.2基因克隆及序列分析19-34
• 1、材料与方法19-26
• 1.1 植物材料、试剂及仪器19-21
• 1.1.1 植物材料培养及低温处理方法19-20
• 1.1.2 试剂及引物20
• 1.1.3 仪器20-21
• 1.2 总RNA提取21-22
• 1.3 cDNA的制备22-23
• 1.4 ZjDREB2.2基因克隆23-25
• 1.4.1 ZjDREB2.2的PCR扩增23-24
• 1.4.2 ZjDREB2.2基因与T载体连接24-25
• 1.5 ZjDREB2.2基因的生物信息学分析25-26
• 2、结果与分析26-33
• 2.1 RNA提取效果26-27
• 2.2 cDNA的制备效果27-28
• 2.3 DREB2.2的PCR扩增28
• 2.4 ZjDREB2.2基因的生物信息学分析28-33
• 3、讨论33-34
• 第三章 结缕草ZjDREB2.2基因表达的逆境响应模式34-42
• 1 、材料与方法34-36
• 1.1 试剂及仪器34-35
• 1.1.1 试剂及引物34-35
• 1.1.2 植物材料培养及逆境处理方法35
• 1.2 总RNA提取和cDNA的制备35
• 1.3 cDNA的制备35-36
• 1.4 ZjDREB2.2基因的半定量RT-PCR36
• 2、结果与分析36-40
• 2.1 样品RNA提取36-37
• 2.2 cDNA的检验与模板上样量的确定37-38
• 2.3 不同逆境胁迫下ZjDREB2.2的表达情况38-40
• 2.3.2 不同温度条件下ZjDREB2.2的表达情况39
• 2.3.3 低温胁迫下匍匐茎和根组织中ZjDREB2.2的表达情况39-40
• 3、讨论40-42
• 第四章 日本结缕草ZjDREB2.2基因转录因子的活性鉴定42-56
• 1、材料与方法42-49
• 1.1 实验材料、试剂42-43
• 1.2 酵母表达载体构建43-47
• 1.2.1 带有attB位点的ZjDREB2.2核酸片段PCR扩增43-44
• 1.2.2 入门载体构建44-45
• 1.2.3 目标载体构建45-47
• 1.3 酵母感受态细胞的制备及转化47
• 1.4 ZjDREB2.2转录激活功能检测47-48
• 1.5 ZjDREB2.2基因DNA结合功能检测48-49
• 2、结果与分析49-54
• 2.1 带attB位点的ZjDREB2.2基因片段PCR扩增49
• 2.2 pDonr221-ZjDREB22重组载体构建49-50
• 2.3 含融合基因AD-ZjDREB2.2和BD-ZjDREB2.2载体构建50-51
• 2.4 ZjDREB2.2基因转录激活功能鉴定51-52
• 2.5 ZjDREB2.2基因DRE结合功能鉴定52-54
• 3、讨论54-56
• 第五章 日本结缕草ZjDREB2.2基因表达载体构建及遗传转化56-65
• 1、材料与方法56-60
• 1.1 植物材料及菌株56
• 1.2 试剂及引物56-57
• 1.3 ZjDREB2.2基因植物表达载体的构建57-58
• 1.4 农杆菌感受态细胞的制备及转化58
• 1.5 蘸花法转化拟南芥58-59
• 1.6 拟南芥抗性植株的筛选及PCR鉴定59-60
• 2、结果与分析60-63
• 2.1 植物表达载体pZP212-ZjDREB2.2的构建60-61
• 2.2 抗性植株筛选和PCR鉴定61-63
• 2.3 转基因植株的表型特征63
• 3、讨论63-65
• 第六章 全文总结及研究展望65-66
• 参考文献66-72
• 致谢72-74
• 缩略词74-75
• 攻读学位期间发表的学术论文目录75

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