农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米幼胚的研究

发布时间：2017-06-08 23:04

  本文关键词：农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米幼胚的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：作为世界上的第二大玉米生产国,我国玉米的种植面积和产量不断增加,目前已超过水稻成为中国的第一大粮食作物。中国玉米生产长期处于自给自足的平衡状态,2010年、2012年中国先后成为玉米净进口国,我国在玉米进出口关系上的转变,使提高国内玉米产量的任务更加紧迫。玉米生长处于高温、高湿季节,杂草危害严重,化学除草是消除杂草危害、保证玉米增产增收的重要除草方式。草甘膦作为目前使用范围最广的灭生性除草剂,在杀死杂草的同时,对农作物同样具有杀死作用。通过植物基因工程育种使玉米获得草甘膦抗性,是解决这一矛盾的有效手段。本研究通过酶切连接法改造植物表达载体pCAMBIA3301-epsps,使抗草甘膦基因2mG2-epsps处于玉米泛素蛋白启动子之后,用农杆菌介导法转化玉米自交系18-599R及Hi-II幼胚,并对幼胚转化系统进行了优化,获得了T0代转基因植株。通过对转基因植株的PCR检测和测序验证,表明目的基因2mG2-epsps已整合到玉米基因组中。主要结果如下：1、植物表达载体pCAMBIA3301-epsps的改造。将pCAMBIA3301上草甘膦基因2mG2-epsps前的CaMV35S启动子换成玉米泛素蛋白启动子Ubiquitin启动子。作为玉米自身基因的启动子,用它驱动外源基因转化玉米时,可以降低外源基因在转基因个体中的拷贝数,从而避免基因沉默现象的发生。2、玉米幼胚作为遗传转化的外植体,通过影响出愈率来影响农杆菌介导玉米转化效率。本研究用0.8-2.0 mm大小的幼胚,在菌液浓度为OD600=0.4-0.6,浸染时间为10 min的条件下进行处理,恢复培养后统计出愈率。结果显示,0.8-1.2 mm、1.2-1.5 mm、1.5-2.0 mm时的出愈率分别为93%、74%、38%,证明幼胚的大小为0.8-1.5 mm时均可以作为农杆菌介导玉米遗传转化的受体。3、浸染后在恢复培养基中使用400mg/L的头孢来抑制农杆菌的继续生长,为保证抗性愈伤组织的形成,筛选培养基中同样需要添加头孢。实验中用200 mg/L、400mg/L、600mg/L的头孢进行处理,在1.2mmol/L草甘膦筛选培养基中筛选15天后统计抗性愈伤率,结果表明筛选培养基中仍使用400 mg/L的头孢才能保证较高的抗性愈伤率。4、菌液浓度、浸染时间及二者的交互作用均对浸染效率影响显著,按照两因素三水平设计9个处理,三次重复。实验结果显示,菌液浓度OD600=0.6,浸染时间为10 min时,1.5 mmol/L草甘膦筛选15天后的平均抗性愈伤率最高,为37.33%。菌液浓度为OD600=0.4时,可适当延长浸染时间来提高浸染效率。5、对18-599R和Hi-II幼胚的农杆菌介导法进行比较,结果发现Hi-II比18-599R更早形成愈伤,且愈伤组织增长速度更快,对草丁膦的筛选也更快作出反应。实验中获得78株18-599R再生植株,9株PCR检查呈阳性,阳性率为11.5%；获得18株Hi-II再生植株,5株PCR检查呈阳性,阳性率为27.8%。所以,Hi-II比18-599R更适合作为玉米遗传转化的受体材料,但授粉困难。选择合适的栽种条件,保证Hi-II幼胚的稳定供给,是其作为玉米遗传转化受体先决条件。6、转基因再生植株畸形现象严重,从实验室到大田条件变化大,植株长势弱,雌雄穗花期不协调,造成授粉困难,难以获得可育后代。实际中可通过姊妹杂交,或与亲本杂交来获得T1代种子。
【关键词】：18-599R Hi-Ⅱ 农杆菌介导 2mG_2-epsps基因 ubiquitin启动子
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S513
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文献综述10-20
• 1.1 草甘膦11-12
• 1.1.1 草甘膦的除草机制11-12
• 1.1.2 生物对草甘膦的抗性12
• 1.2 转基因玉米研究进展12-14
• 1.2.1 转基因玉米研究进展13
• 1.2.2 抗草甘膦玉米研究进展13-14
• 1.3 农杆菌介导的玉米遗传转化14-18
• 1.3.1 农杆菌介导法原理15
• 1.3.2 农杆菌介导法的影响因素15-18
• 1.4 启动子18-19
• 1.5 研究目的意义19-20
• 2 材料与方法20-31
• 2.1 实验材料20-22
• 2.1.1 玉米材料20
• 2.1.2 菌株、质粒20
• 2.1.3 仪器、试剂20
• 2.1.4 母液配制20-22
• 2.1.5 培养基22
• 2.2 实验方法22-31
• 2.2.1 pCAMBIA3301-epsps植物表达载体的改造22-26
• 2.2.2 植物表达载体转化农杆菌26-27
• 2.2.3 农杆菌浸染法转化玉米幼胚27-30
• 2.2.4 转基因植株的分子检测30-31
• 3 结果与分析31-43
• 3.1 植物表达载体的改造31-34
• 3.1.1 ubiquitin启动子的获得31-32
• 3.1.2 pCAMBIA3301-epsps表达载体改造32-34
• 3.2 农杆菌介导玉米遗传转化34-41
• 3.2.1 幼胚大小对出愈率的影响35-36
• 3.2.2 筛选时头孢浓度的选择36-37
• 3.2.3 浸染浓度和浸染时间的确定37-39
• 3.2.4 18-599R与Hi-ll转化率比较39-41
• 3.3 转基因植株的分子检测41-43
• 3.3.1 T0代转基因植株的PCR检测41-42
• 3.3.2 转基因植株的测序验证42-43
• 3.4 转基因畸形苗43
• 4 讨论43-48
• 4.1 植物表达载体的构建43-44
• 4.2 农杆菌介导玉米遗传转化体系的优化44-46
• 4.2.1 基因型的影响44-45
• 4.2.2 幼胚大小的影响45
• 4.2.3 菌液浓度和浸染时间的影响45-46
• 4.2.4 筛选时头孢浓度的使用46
• 4.3 转基因植株的检测46-48
• 参考文献48-52
• 致谢52

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本文编号：433903