仿刺参生长相关基因的克隆与表达

发布时间：2017-06-09 10:20

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【摘要】：仿刺参(Apostichopus japonicus)俗称刺参,属于棘皮动物门(Echinodermata),海参纲(Holothuroidea),循手目(Aspidochirota),刺参科(Stichopodidae),仿刺参属(Apostichopus)。仿刺参是一种非常重要的海洋经济棘皮动物,近十几年仿刺参生长的研究取得较大进展,尤其是水温、盐度、光照、附着基、养殖密度和饵料等环境因素对刺参生长影响的相关研究已经较多和深入,在遗传和发育生物学方面的研究也有一定进展。但是,关于生长方面的分子遗传学研究非常少。细胞周期蛋白B(Cyclin B)、卵泡抑素(Follistatin,Fst)和下效应蛋白(Tensilin)基因是参与生长调控的相关基因,在刺参的生长发育过程中起着重要作用。Cyclin B主要通过控制细胞分裂G2/M这个转换点来调控细胞分裂,是真核细胞周期运转中起关键作用的调控因子。卵泡抑素是一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽,是转化生长因子β超家族成员之一,抑制促卵泡素(FSH)的分泌。下效应蛋白是一种胶原纤维结合蛋白,是由仿刺参真皮的内部的一层异变的胶原组织产生。本实验以仿刺参为原料,利用分子生物学技术,首次克隆了cyclin B、follistatin、tensilin基因,获得了3个基因cDNA全序列。通过生物信息学分析发现,cyclin B基因包含一个717bp的开放阅读框,编码一个由238个氨基酸组成的蛋白,follistatin基因包含一个1254bp的开放阅读框,编码一个由417个氨基酸组成的蛋白,tensilin基因包含一个822bp的开放阅读框,编码一个由273个氨基酸组成的蛋白。对这三种基因编码的蛋白质进行预测分析。Cyclin B包括一个CYCLIN功能结构域,无信号肽无跨膜结构域。Follistatin包括6个功能结构域,按顺序分别是FOLN、KAZAL、FOLN、KAZAL、FOLN、KAZAL结构域,有信号肽无跨膜结构域。Tensilin包括一个NTR功能结构域,有信号肽无跨膜结构域。用实时定量PCR(Real-Time qPCR)技术,对cyclin B、follistatin、tensilin基因在大小仿刺参不同组织的表达量分别进行研究。发现cyclin B基因在大个体仿刺参中的相对表达量要略高于小个体的表达量,体液和肌肉中差异极显著,在呼吸树中差异显著。follistatin基因在小个体仿刺参中各组织相对表达量要略高,在肠中表达量差异显著,其余差异不显著。小个体仿刺参体壁最高为1.14,呼吸树为0.047。tensilin基因在呼吸树的表达量最高为1.14,体液的表达量最低为0.067。利用基因组步移(Genome Walking)方法,对cyclin B基因进行了启动子的克隆,得到了2564bp的启动子序列,利用启动子转录结合位点预测程序进行预测,预测结果显示有7个结合位点,分别为v-Myb、HNF-1、Evi-1、Elk-1、NF-Y、HNF、USF。
【关键词】：仿刺参 细胞周期蛋白B基因 卵泡抑素基因 下效应蛋白基因
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1.前言9-15
• 1.1 仿刺参概述9-12
• 1.1.1 仿刺参的特征简介9
• 1.1.2 仿刺参的养殖现状及存在的问题9-10
• 1.1.3 仿刺参生长发育以及再生相关基因研究进展10-11
• 1.1.4 仿刺参生长相关问题的解决办法和展望11
• 1.1.5 仿刺参生长相关问题的研究意义11-12
• 1.2 生长相关基因cyclin B、follistatin、tensilin介绍12-15
• 1.2.1 Cyclin B的作用机制12-13
• 1.2.2 Follistatin作用机制及研究情况13-14
• 1.2.3 Tensilinz功能与研究情况简介14-15
• 2.材料及方法15-27
• 2.1 材料15-16
• 2.1.1 仿刺参的取样15
• 2.1.2 主要仪器与设备15-16
• 2.1.3 主要试剂16
• 2.2 方法16-27
• 2.2.1 仿刺参不同组织总RNA和DNA的提取16-19
• 2.2.2 3′ RACE扩增19-20
• 2.2.3 5′ RACE扩增20-22
• 2.2.4 内含子的扩增22-23
• 2.2.5 启动子的扩增23-25
• 2.2.6 实时定量PCR25-27
• 3.结果27-43
• 3.1 PCR扩增结果及序列分析27-32
• 3.2 cDNA序列信息学分析32-40
• 3.2.1 氨基酸序列32-35
• 3.2.2 编码蛋白的信号肽预测35-37
• 3.2.3 跨膜结构域预测37-39
• 3.2.4 功能结构域预测39-40
• 3.3 cyclin B基因启动子序列转录结合位点分析预测40-41
• 3.4 实时定量PCR41-43
• 4.讨论43-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况51-52
• 致谢52

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本文编号：435178