鸡TBK1基因的克

发布时间：2017-06-09 13:07

  本文关键词：鸡TBK1基因的克隆、表达及其对IRF3信号转导通路的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：TBK1(别名T2K,NAK)是非经典IκB激酶家族成员之一,具有诸多生物学功能,其中包括参与炎性反应、细胞凋亡和先天免疫等,也是治疗诸多疾病(神经性炎症、自身免疫疾病、肿瘤性疾病)以及控制病毒性感染的潜在药物治疗靶点。近年来的研究发现,TBK1是先天免疫模式识别受体信号转导通路上的核心蛋白,在调控先天抗病原微生物免疫上具有重要的作用,但关于该基因是否在鸡先天免疫中发挥作用,怎样作用还未有报道。为此,本试验以鸡TBK1为目标基因,利用分子克隆技术对鸡TBK1基因进行了克隆；通过RT-PCR技术检测了鸡TBK1基因在鸡不同组织中的表达；选用SPF鸡进行了机体ALV-J攻毒试验,检测机体在抵御病毒过程中鸡TBK1的表达量变化；以鸡胚成纤维细胞为细胞模型,进行细胞ALV-J刺激和polyI:C转染试验,检测了细胞在病毒入侵过程中鸡TBK1的表达量变化。获得以下主要结果：(1)鸡TBK1基因的CDS区全长为2190bp,编码729个氨基酸；鸡TBK1基因与其他鸟类和哺乳类的同源性均较高,在85%以上,在进化上相对保守；鸡TBK1具有两个保守结构域(激酶结构域和泛素样结构域),位于该蛋白的氮端,且激酶结构域具有两个重要的位点,ATP结合位点和第172为的丝氨酸位点。(2)鸡TBK1基因在组织中广泛表达,且在免疫组织(脾、胸腺、法氏囊)中的表达量显著高于其他组织(P0.01)。(3)与对照组相比,SPF鸡机体ALV-J攻毒组鸡TBK1基因的mRNA表达量在脾脏、胸腺、法氏囊中显著上升(P0.05或P0.01)；ALV-J和polyI:C刺激的鸡胚成纤维细胞组鸡TBK1基因的mRNA表达量也显著上升(P0.01)；以上结果说明TBKl参与鸡机体以及鸡细胞的抗病毒反应。(4) ALV-J和polyI:C刺激的鸡胚成纤维细胞中,IRF3、IFNβ和IFNα的表达量的显著上升(P0.01)；与阴性对照(NC)相比,鸡TBK1基因干扰细胞组的IRF3、IFNβ和IFNα的表达量受到了显著的影响(P0.05或P0.01),上述结果说明TBK1正调控IRF3、IFNβ和IFNα的表达。
【关键词】：鸡 TBK1 克隆 表达 先天免疫
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S831
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 主要符号说明8-11
• 1 文献综述11-24
• 1.1 IKB蛋白激酶家族简介11-12
• 1.2 TBK1的简介12-16
• 1.2.1 TBK1的发现与结构12-13
• 1.2.2 TBK1的活性的调节13-15
• 1.2.3 TBK1的主要功能15-16
• 1.3 TBK1在先天免疫中的主要作用16-22
• 1.3.1 TBK1在先天免疫模式识别受体信号转导通路中的作用16-19
• 1.3.2 TBK1激活的下游信号转导通路19-21
• 1.3.3 TBK1的主要支架蛋白21-22
• 1.3.4 TBK1与病毒间的相互作用22
• 1.4 本试验的目的和意义22-24
• 2 材料与方法24-36
• 2.1 试验动物及病毒来源24
• 2.2 试验试剂与耗材24-26
• 2.2.1 主要试剂及试剂盒24-25
• 2.2.2 主要仪器设备25-26
• 2.3 技术路线26-27
• 2.4 试验方法27-35
• 2.4.1 CDNA模板的制备27-28
• 2.4.2 TBK1基因的克隆28-31
• 2.4.3 机体试验31-32
• 2.4.4 细胞试验32-34
• 2.4.5 荧光定量PCR34-35
• 2.5 数据统计分析35-36
• 3 结果与分析36-53
• 3.1 鸡TBK1基因的生物信息学分析36-41
• 3.1.1 鸡TBK1基因CDS区的克隆36
• 3.1.2 鸡TBK1的核酸氨基酸序列及同源性分析36-38
• 3.1.3 TBK1的理化性质和蛋白结构分析38-40
• 3.1.4 TBK1的多序列比对及进化树构建40-41
• 3.2 机体诱导表达试验结果41-46
• 3.2.1 RNA提取效果的检测41-42
• 3.2.2 目的基因的扩增曲线和溶解曲线42-44
• 3.2.3 鸡TBK1基因的组织表达谱44
• 3.2.4 ALV-J病毒感染不同组织TBK1基因的差异表达44-46
• 3.3 细胞病毒诱导试验结果46-49
• 3.3.1 鸡胚成纤维细胞ALV-J病毒处理后相关基因的差异表达46-48
• 3.3.2 鸡胚成纤维细胞POLYI：C转染后相关基因的差异表达48-49
• 3.4 TBK1基因细胞干扰试验结果49-53
• 3.4.1 SIRNA对TBK1基因的干扰效率49-50
• 3.4.2 SIRNA干扰对ALV-J刺激下TBK1及其下游基因表达的影响50-51
• 3.4.3 SIRNA干扰对POLYI：C刺激下TBK1及其下游基因表达的影响51-53
• 4 讨论53-58
• 4.1 鸡TBK1基因的克隆及其分子特征分析53-54
• 4.2 TBK1基因的组织表达谱分析54
• 4.3 TBK1基因的诱导表达分析54-56
• 4.3.1 ALV-J刺激下TBK1基因在机体上的差异表达54-55
• 4.3.2 ALV-J刺激下TBK1基因在细胞中差异表达55-56
• 4.3.3 POLYI：C刺激下TBK1基因在细胞中差异表达56
• 4.4 TBK1对IRF3、IFNB和IFNA的影响56-58
• 5 结论58-59
• 参考文献59-66
• 致谢66-67
• 攻读学位期间发表的学术论文与授权专利67

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