H_2S诱导白桦悬浮细胞中次生代谢物累积的激素生理机制的初步研究

发布时间：2017-06-15 15:13

  本文关键词：H_2S诱导白桦悬浮细胞中次生代谢物累积的激素生理机制的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本实验以白桦悬浮细胞为材料,将不同浓度硫化氢(H2S)供体硫氢化钠(NaHS)添加到白桦悬浮培养体系中,筛选有利于白桦悬浮细胞生长、三萜、黄酮和多酚等次生代谢物积累的NaHiS处理浓度和时间,并分析细胞内吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和多胺(PAs)的含量及其合成关键酶的活性或基因表达量。同时分析不同浓度IAA、ABA、PAs与NaHiS共处理对白桦悬浮细胞生长和次生代谢物积累的影响。通过上述研究初步明确内源性激素和次生代谢物对H2S的响应,同时为明确白桦悬浮细胞中次生代谢积累的机制奠定基础。主要研究结果如下：1.H2S对白桦悬浮细胞防御生理的影响将0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L 和 5mmol/L NaHS分别添加到培养8d的白桦悬浮培养体系中处理3-96h,研究发现0.1mmol/L NaHiS处理提高了细胞活力同时促进了细胞生长,而高于1mmol/L NaHS处理则降低细胞活力和抑制细胞生长。其中,0.1mmol/L NaHS处理96h时细胞活力最高,比对照组提高了37.66%。而5mmol/LNaHiS处理96h时细胞活力最低,降低至对照组的24.09%。不同浓度NaHiS处理对pH、电导率和丙二醛含量的影响发现,01mmol/LNaHS对pH、电导率和丙二醛含量的影响不显著,与对照组相近。而高于1mmol/L NaHS处理则pH降低、电导率和丙二醛含量增加,其中5mmol/LNaHS处理96h时达到最大值,pH值下降0.73,电导率提高了89.15%,丙二醛含量提高了44.62%。不同浓度NaHiS处理对超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)防御酶的影响发现,除01mmol/L NaHS处理外,细胞内防御酶活性均显著提高。其中1mmol/L NaHS处理96h时SOD活性最高,比对照组提高了41.04%。1mmol/L NaHS处理24h时POD活性最高,比对照组提高了94.55%。1mmol/L NaHS处理48h时CAT活性最高,比对照组提高了150%。0.5mmol/LNaHS处理24h时PAL活性最高,比对照组提高了71.43%。2.H2S对白桦悬浮细胞中次生代谢物积累的影响利用不同浓度NaHiS处理白桦悬浮细胞。除5mmol/L NaHS外,NaHiS处理提高了白桦悬浮细胞中次生代谢物含量。其中1mmol/L NaHS处理24h时次生代谢产物含量最高,三萜、黄酮、多酚含量分别比对照组提高了36.67%、28.57%、36.89%。低浓度NaHiS处理有利于白桦悬浮细胞的生长,而较高浓度的NaHiS处理有利于次生代谢物的累积,NaHiS对次生代谢产产物促进作用多酚三萜黄铜。3.H2S对白桦悬浮细胞中内源性激素含量和合成关键酶基因表达的影响利用不同浓度NaHiS处理白桦悬浮细胞。NaHiS处理降低了细胞内IAA含量,而增加了ABA.JA和PAs含量。(1)0.5mmol/L以上NaHS处理组IAA含量逐渐降低。其中在次生代谢产物积累最高的1mmol/L NaHS处理24h时IAA含量仅占对照组的46.78%,此时GH3.5A、GH3.5B、GH3.9A三个基因表达量分别比对照组提高158.12%、307.47%、509.73%倍(TU内参)；(2)NaHiS处理后ABA含量呈现先升高后下降的趋势。其中1nmol/L NaHS处理12h时ABA含量最高,比对照组提高了196.46%。而NCED4基因在1 mmol/L NaHS处理6h时表达量最高,比对照组提高了431.85%。(3)NaHS处理后总PAs含量提高。其中,1mmol/L NaHS处理12h时精胺酸脱羧酶活性最高比对照提高了15.91%,96h时总腐胺含量最高比对照组提高了20.34%。0.5mmol/L NaHS处理48h时S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶活性最高比对照提高了74.15%,总亚精胺含量最高比对照组提高8.41%(4)NaHiS处理后JA含量呈先提高后降低趋势。其中1mmol/L NaHS处理12h时脂氧合酶活性最高,比对照组提高了22.39%,24h时JA含量最高,比对照组提高了67.17%。NaHS处理后激素调控相关基因与激素合成酶活性改变诱导了细胞内源性激素含量的变化。下面继续探究激素含量与次生代谢产物积累的关系。4.H2S与激素共处理对白桦悬浮细胞次生代谢积累的影响将不同浓度的IAA.ABA.Put.Spd.Spm分别添加到8天的白桦悬浮细胞中,使培养基中不同激素终浓度为01mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L 和5 mmol/L。同时分别将上述不同激素的浓度处理与1mmol/L的硫氢化钠共处理白桦悬浮细胞处理24h。研究发现IAA处理降低了次生代谢产物积累,而ABA和PAs处理促进了次生代谢产物的积累。(1)5mmol/L IAA处理次生代谢产物含量最低,多酚、黄酮和三萜含量分别为对照组的88.28%、86.44%和78.91%。5mmo1/L IAA和1mmol/L硫氢化钠共处理次生代谢产物含量比IAA处理组提高,多酚、黄酮和三萜含量分别为对照组的111.16%、107.39%和93.82%。(2)1mmol/L ABA处理次生代谢产物含量最高,多酚.黄酮和三萜含量分别比对照组提高17.85%、23.48%和16.73%。1mmol/L ABA和1mmol/L硫氢化钠共处理次生代谢产物含量提高,多酚、黄酮和三萜含量分别比对照组提高58.19%、46.02%和57.30%。(3)5mmol/L腐胺处理组中三萜含量最高比对照组提高了22.91%,与硫氢化钠共处理时三萜含量比对照提高了68.00%1mmol/L精胺处理组中黄酮含量最高比对照提高了31.09%,与硫氢化钠共处理时黄酮含量比对照组提高了48.62%。05mmol/L亚精胺处理组中多酚含量最高比对照组提高了37.17%,与硫氢化钠共处理时多酚含量比对照提高了75.91%。相关性分析发现IAA和Put与次生代谢产物积累显著相关,低于1mmol/L的ABA.Spd和SPM促进次生代谢产物积累。IAA.ABA.PAs和JA与硫化氢互作促进次生代谢产物积累。
【关键词】：白桦(Betula platyphylla Suk) 硫化氢 次生代谢物 激素
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S792.153;Q942.5
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 绪论12-18
• 1.1 白桦简介12
• 1.2 H_2S信号分子的研究进展12-13
• 1.2.1 H_2S的理化性质及其来源途径12
• 1.2.2 H_2S在代谢调控中的研究进展12-13
• 1.3 植物激素的研究概况13-14
• 1.3.1 IAA的研究进展13-14
• 1.3.2 ABA的研究进展14
• 1.3.3 多胺的研究概况14
• 1.3.4 JA的研究概况14
• 1.4 植物细胞生理14-16
• 1.4.1 pH值15
• 1.4.2 细胞干重积累量15
• 1.4.3 丙二醛含量15
• 1.4.4 培养液电导率15
• 1.4.5 细胞活力15
• 1.4.6 细胞抗氧化酶活性15-16
• 1.4.7 脂氧合酶活性16
• 1.4.8 苯丙氨酸解氨酶活性16
• 1.4.9 多胺合成分解酶活性16
• 1.5 本研究的目的意义16-18
• 2 材料与方法18-27
• 2.1 材料来源与细胞培养18
• 2.2 诱导子处理18
• 2.2.1 硫化氢处理18
• 2.2.2 硫化氢与激素共同处理18
• 2.3 细胞生理指标的测定18-19
• 2.3.1 pH值测定18
• 2.3.2 电导率测定18
• 2.3.3 丙二醛含量的测定18-19
• 2.3.4 细胞活力的测定19
• 2.4 酶活性的测定19-21
• 2.4.1 抗氧化相关酶活性19-20
• 2.4.2 脂氧合酶活性20
• 2.4.3 PAL酶活性20
• 2.4.4 多胺合成酶活性20-21
• 2.4.5 多胺分解酶活性21
• 2.5 HPLC法测定多胺含量21-23
• 2.6 次生代谢产物含量的测定23-24
• 2.6.1 三萜含量的测定23
• 2.6.2 黄酮含量的测定23
• 2.6.3 多酚含量的测定23-24
• 2.7 ELISA法测定激素含量24
• 2.8 实时荧光定量PCR检测激素合成基因表达24-27
• 3 结果与分析27-51
• 3.1 硫化氢对白桦悬浮细胞生理指标的影响27-30
• 3.1.1 硫化氢对白桦悬浮细胞干重积累的影响27-28
• 3.1.2 硫化氢对白桦悬浮细胞培养液pH的影响28
• 3.1.3 硫化氢对白桦悬浮细胞培养液电导率的影响28-29
• 3.1.4 硫化氢对白桦悬浮细胞细胞活力的影响29
• 3.1.5 硫化氢对白桦悬浮细胞中丙二醛含量的影响29-30
• 3.1.6 小结30
• 3.2 硫化氢对白桦悬浮细胞中次生代谢物积累的影响30-34
• 3.2.1 硫化氢对白桦悬浮细胞中三萜积累的影响30-31
• 3.2.2 硫化氢对白桦悬浮细胞中黄酮积累的影响31-32
• 3.2.3 硫化氢对白桦悬浮细胞中多酚积累的影响32-33
• 3.2.4 小结33-34
• 3.3 硫化氢对白桦悬浮细胞中内源性IAA的影响34-37
• 3.3.1 硫化氢对白桦悬浮细胞中IAA含量的影响34
• 3.3.2 硫化氢对白桦悬浮细胞中IAA调控关键基因表达的影响34-37
• 3.3.3 小结37
• 3.4 硫化氢对白桦悬浮细胞中内源性ABA的影响37-40
• 3.4.1 硫化氢对白桦悬浮细胞中ABA含量的影响37-38
• 3.4.2 硫化氢对白桦悬浮细胞中ABA合成基因表达的影响38-39
• 3.4.3 小结39-40
• 3.5 硫化氢对白桦悬浮细胞中内源性多胺的影响40-44
• 3.5.1 硫化氢对白桦悬浮细胞中三种状态多胺含量的影响40-42
• 3.5.2 硫化氢对白桦悬浮细胞中多胺合成分解酶活性的影响42-44
• 3.5.3 内源性腐胺、亚精胺与次生代谢产物含量的相关性分析44
• 3.5.4 小结44
• 3.6 硫化氢对白桦悬浮细胞中内源性JA的影响44-46
• 3.6.1 硫化氢对白桦悬浮细胞中JA含量的影响44-45
• 3.6.2 硫化氢对白桦悬浮JA合成酶(LOX)活性的影响45
• 3.6.3 内源性JA含量与植物次生代谢产物含量的相关分析45
• 3.6.4 小结45-46
• 3.7 硫化氢对白桦悬浮细胞中抗氧化酶的影响46-48
• 3.7.1 硫化氢对白桦悬浮细胞中SOD活性的影响46
• 3.7.2 硫化氢对白桦悬浮细胞中CAT活性的影响46-47
• 3.7.3 硫化氢对白桦悬浮细胞中POD活性的影响47
• 3.7.4 硫化氢对白桦悬浮细胞中PAL酶活性的影响47-48
• 3.7.5 小结48
• 3.8 硫化氢与激素共的研究48-51
• 3.8.1 硫化氢与激素共同处理对白桦悬浮细胞的影响48-50
• 3.8.2 外源激素与次生代谢产物含量的相关性与回归拟合分析50
• 3.8.3 小结50-51
• 4 讨论51-55
• 4.1 H_2S对白桦悬浮细胞中次生代谢产物积累的影响研究51
• 4.2 H_2S对白桦悬浮细胞中抗氧化酶的影响研究51-52
• 4.3 IAA在H_2S诱导白桦悬浮细胞中次生代谢产物积累作用的研究52
• 4.4 ABA在H_2S诱导白桦悬浮细胞中次生代谢产物积累作用的研究52-53
• 4.5 多胺在H_2S诱导白桦悬浮细胞中次生代谢产物积累作用的研究53-54
• 4.6 JA在H_2S诱导白桦悬浮细胞中次生代谢产物积累作用的研究54-55
• 结论55-57
• 参考文献57-62
• 攻读学位期间发表的学术论文62-63
• 致谢63-64

【参考文献】

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