高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2抗体制备与重组分析

发布时间：2017-06-26 03:00

  本文关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2抗体制备与重组分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的急性传染病。该病毒分为欧洲型和美洲型两种基因型。2006年,我国爆发高致病性PRRS,给养猪产业带来极大的冲击。NSP2是PRRSV中分子量最大、变异最大的蛋白,常作为PRRSV监控的靶点,同时其在PRRSV的复制、免疫、引发宿主细胞自噬和凋亡中发挥着重要功能。本研究分离鉴定了1株2012年黑龙江省的美洲型HP-PRRSV,并命名为HH12株。应用RT-PCR技术成功克隆HH12株和实验室已鉴定的2株HP-PRRSV(Jilin TN1株和Jilin TN2株)的NSP2全长基因,测序结果3个分离株NSP2全长均为2850 bp。将所克隆序列与美洲经典型PRRSV NSP2比对,发现3个分离株的NSP2基因均存在HP-PRRSV特征性的30个氨基酸缺失。遗传进化分析表明,3个分离株与HP-PRRSV代表株JXA1 NSP2基因序列相似性为98.5%~98.7%,且在遗传进化树中属于JXA1株为代表的亚群,并与HB0701株处于同一分支。以Jilin TN1株为研究对象,设计并合成能够扩增删除了部分疏水区的NSP2片段的特异性引物,应用RT-PCR对其进行亚克隆,构建p GEX 6p-NSP2重组质粒,转化至E.coli Rostta感受态细胞中通过原核表达重组NSP2蛋白,SDS-PAGE分析其大小约131.5 ku,经Western-blot鉴定纯化复性后的重组蛋白能够与PRRSV阳性血清反应。以该蛋白为免疫原,免疫新西兰兔制备抗血清,4免后检测其效价达1:215,且与HP-PRRSV及经典型PRRSV反应效价可达1:211。western-blot结果表明所获抗血清特异性较高。IFA结果显示该多抗能够检测到Marc-145细胞上繁殖的HP-PRRSV和经典型PRRSV,且能够与p VAX-NSP2转染BHK-21细胞瞬时表达的NSP2蛋白反应。Real-time PCR结果显示该抗体对HP-PRRSV和经典型PRRSV具有较好的抑制效果,对两者的最高抑制率分别为76.0%和58.6%。以上结果说明所制备的多抗生物学活性良好,为NSP2的深入研究提供很重要的基础。以Gen Bank数据库中包括本研究克隆的624条美洲型PRRSV NSP2序列为研究对象,应用RDP4.2软件对NSP2重组事件进行检测,同时应用SIMPLOT软件和MEGA5.2软件从遗传相似性和遗传进化两个角度对重组事件进行验证和分析。检测结果发现11个重组事件,共包含37个重组毒株,占总分析毒株的5.9%(37/624),而本研究3个分离株的NSP2基因未发现重组。美洲变异型、传统型和经典型毒株均发现了重组:其中传统型有3株,经典型有7株,变异型有27株。这些重组事件中不仅存在7个型内重组,还发现了4个型间重组,检测到的型间重组毒株主要由美洲变异型与传统型或经典型通过重组产生。遗传进化分析表明,发生型间重组的毒株具有独特的进化地位。以上结果提示,在美洲型PRRSV的进化过程中NSP2基因片段有重组发生,变异型毒株的出现加快了PRRSV的进化速度并且使其变异情况更加复杂。同时,基因重组可能是PRRSV发生型间转换、甚至产生新基因型的进化基础,这可能会造成新型PRRSV的爆发,这一结果提示需针对PRRSV的变异提出新的防控措施。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP2 原核表达 多抗血清 重组分析
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 前言14-23
• 1.1 PRRS概述14
• 1.2 PRRSV病原学14
• 1.3 PRRSV分子生物学特性14-17
• 1.3.1 PRRSV基因组结构14-15
• 1.3.2 PRRSV非结构蛋白15
• 1.3.3 PRRSV结构蛋白15-17
• 1.4 PRRSV NSP2研究进展17-21
• 1.4.1 NSP2结构和功能17-18
• 1.4.2 NSP2的变异18-19
• 1.4.3 NSP2与PRRSV毒力19-20
• 1.4.4 NSP2与免疫20-21
• 1.4.5 NSP2与疫苗21
• 1.5 研究目的与意义21-23
• 2 材料与方法23-41
• 2.1 实验材料23-26
• 2.1.1 病料23
• 2.1.2 病毒、菌株与载体23
• 2.1.3 细胞与实验动物23
• 2.1.4 实验药品、试剂及标准参照物23-24
• 2.1.5 实验试剂的配制24-25
• 2.1.6 主要仪器和设备25-26
• 2.2 实验方法26-41
• 2.2.1 PRRSV分离和培养26
• 2.2.2 PRRSV IFA鉴定26-27
• 2.2.3 引物设计27
• 2.2.4 PRRSV总RNA的提取27-28
• 2.2.5 NSP2基因RT-PCR28-29
• 2.2.6 NSP2 PCR产物的纯化29
• 2.2.7 NSP2基因的克隆和鉴定29-31
• 2.2.8 NSP2序列遗传进化分析31-33
• 2.2.9 NSP2重组表达质粒构建33
• 2.2.10 NSP2重组表达质粒鉴定33-34
• 2.2.11 NSP2重组蛋白诱导表达34-35
• 2.2.12 重组蛋白纯化、复性与活性鉴定35-36
• 2.2.13 抗NSP2多克隆抗体的制备36
• 2.2.14 抗NSP2多克隆抗体的生物学活性检测36-37
• 2.2.15 Real-time PCR检测抗NSP2多抗对PRRSV抑制作用37-39
• 2.2.16 美洲型PRRSV NSP2基因重组分析39-41
• 3 结果与分析41-69
• 3.1 PRRSV分离和培养41-42
• 3.2 PRRSV IFA检测42-43
• 3.3 NSP2基因RT-PCR扩增和鉴定43
• 3.4 NSP2基因的克隆和鉴定43-45
• 3.4.1 重组克隆质粒PCR鉴定43-44
• 3.4.2 测序及序列比对44-45
• 3.5 NSP2遗传进化分析45-47
• 3.6 NSP2重组表达质粒鉴定47-49
• 3.6.1 重组原核表达质粒鉴定47-48
• 3.6.2 重组真核表达质粒鉴定48-49
• 3.7 NSP2重组蛋白表达49-50
• 3.8 NSP2重组蛋白纯化和活性鉴定50-51
• 3.9 抗NSP2多克隆抗体生物学活性检测51-55
• 3.9.1 间接ELISA检测多抗效价51-52
• 3.9.2 Western-blot检测52-53
• 3.9.3 多抗对细胞感染PRRSV的IFA检测53-54
• 3.9.4 多抗对细胞瞬时表达NSP2蛋白IFA检测54-55
• 3.10 Real-time PCR检测抗nps2多抗对PRRSV抑制作用55-56
• 3.10.1 标准质粒与实时引物的PCR鉴定55
• 3.10.2 标准曲线55-56
• 3.10.3 多抗对PRRSV抑制效果56
• 3.11 美洲型PRRSV NSP2基因重组分析56-69
• 3.11.1 RDP4.2 软件对PRRSV NSP2重组事件检测结果56-57
• 3.11.2 SIMPLOT软件对重组毒株NSP2遗传相似性分析结果57-63
• 3.11.3 重组毒株NSP2遗传进化分析结果63-69
• 4 讨论69-73
• 4.1 PRRSV分离、培养和鉴定69
• 4.2 NSP2的克隆和序列分析69-70
• 4.3 NSP2的原核表达及抗血清制备70-71
• 4.4 美洲型PRRSV NSP2重组分析71-73
• 5 结论73-74
• 致谢74-75
• 参考文献75-85
• 附录85-89
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文89

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本文编号：484490