水稻草状矮化病毒对褐飞虱翅型分化的影响

发布时间：2017-07-03 08:02

  本文关键词：水稻草状矮化病毒对褐飞虱翅型分化的影响

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【摘要】：水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus, RGSV),是纤细病毒属的成员之一,可以引起水稻草状矮化病(Rice grassy stunt disease),简称水稻草矮病,是热带和亚热带地区水稻上的重要病害之一,严重时甚至可造成水稻的绝产。该病毒由昆虫介体褐飞虱(Nilaparvata lugens)以持久、增殖性方式传播。褐飞虱是一种迁飞性害虫,成虫具有明显的翅二型现象。有研究表明,病毒的侵染会对褐飞虱的翅型分化产生影响。本课题通过生物学统计实验、荧光定量PCR实验、酵母双杂交实验、亚细胞共定位实验和原核表达实验对该问题进行了研究,研究结果如下：1、生物学统计实验的结果表明,褐飞虱携带RGSV种群和无毒种群成虫的翅型分化存在显著差异,其中无毒虫的短翅型比例为23.17±0.56%,长翅型比例为60.43±0.22%。而饲过毒的褐飞虱短翅型的比例为36.26±0.42%,长翅型比例为52.32±1.16%。2、通过实时荧光定量qRT-PCR实验对褐飞虱翅型分化相关基因flightin、 Tnc、Titin、LN-a2在褐飞虱体内的表达量进行了测定,结果表明,RGSV侵染后,各基因均表现为下调。3、成功的构建了酵母表达载体pGADT7-flightin。通过酵母双杂交实验得出褐飞虱flightin蛋白能够与RGSV的P1,P3,P5蛋白产生互作。4、成功构建了瞬时表达载体pEarly gate 101-flightin和pEarly gate 102-flightin。通过亚细胞共定位实验进一步验证了flightin与RGSV的P1,P3,P5蛋白之间的互作。5、成功构建了原核表达载体pDEST17-flightin,制备了褐飞虱flightin基因的多克隆抗体,Western blot实验的检测结果表明,所制备的抗血清能够特异性地检测褐飞虱体内的flightin蛋白,间接ELISA检测结果表明所制备的抗体效价为1：6400。综上所述,本研究基本明确了水稻草状矮化病毒对褐飞虱翅型分化的影响,并通过分子生物学相关实验筛选到部分关键基因,为进一步的研究奠定了良好的基础。
【关键词】：水稻草状矮化病毒 褐飞虱 翅型分化 flightin基因
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.11
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 前言12-25
• 1.1 水稻草状矮化病毒研究概况12-18
• 1.1.1 病害的发生、分布12-13
• 1.1.2 病毒的形态和特性13
• 1.1.3 病毒与寄主13-14
• 1.1.4 RGSV基因组结构及其功能14-17
• 1.1.5 血清学17
• 1.1.6 病害防治17-18
• 1.2 翅型分化研究进展18-19
• 1.2.1 植物病毒对蚜虫翅型分化的影响18-19
• 1.2.2 褐飞虱翅型分化相关基因19
• 1.3 本研究中用到的关键核心技术19-23
• 1.3.1 荧光定量PCR技术19-21
• 1.3.2 酵母双杂交技术21-23
• 1.4 本研究的目的和意义23-25
• 第二章 褐飞虱无毒种群与感染RGSV种群翅型分化生物学统计25-31
• 2.1 材料、试剂及仪器25-26
• 2.1.1 水稻病株与褐飞虱25
• 2.1.2 实验试剂25
• 2.1.3 实验仪器25
• 2.1.4 RGSV检测引物25-26
• 2.2 方法26-28
• 2.2.1 褐飞虱成虫翅型统计26
• 2.2.2 褐飞虱总RNA的提取26-27
• 2.2.3 反转录RT-PCR27
• 2.2.4 PCR反应27-28
• 2.3 结果与分析28-29
• 2.3.1 翅型统计结果28-29
• 2.3.2 PCR检测褐飞虱带毒率29
• 2.4 小结与讨论29-31
• 第三章 实时荧光定量qRT-PCR检测翅型分化相关基因的表达量31-39
• 3.1 材料、试剂及仪器31-32
• 3.1.1 水稻病株与褐飞虱31
• 3.1.2 实验试剂31
• 3.1.3 实验仪器31
• 3.1.4 荧光定量PCR引物31-32
• 3.2 方法32-33
• 3.2.1 荧光定量PCR引物的筛选32-33
• 3.2.2 基因标准曲线的绘制33
• 3.2.3 实时荧光定量qRT-PCR检测褐飞虱翅型分化相关基因的表达量33
• 3.3 实验结果与分析33-37
• 3.3.1 目的基因及其内参基因的融解曲线33-35
• 3.3.2 目的基因及其内参基因的标准曲线35-37
• 3.3.3 褐飞虱翅型分化相关基因的表达量37
• 3.4 小结与讨论37-39
• 第四章 利用酵母双杂交系统研究flightin与RGSV各蛋白之间的互作情况39-48
• 4.1 材料及试剂39
• 4.1.1 实验材料39
• 4.1.2 引物设计39
• 4.2 方法39-44
• 4.2.1 目的基因酵母表达载体的构建39-42
• 4.2.2 AH109酵母感受态细胞的制备42
• 4.2.3 重组质粒共转化酵母感受态细胞42-43
• 4.2.4 蛋白互作的检测43-44
• 4.3 结果与分析44-47
• 4.3.1 PCR扩增目的基因44
• 4.3.2 重组质粒的菌液PCR鉴定44-45
• 4.3.3 重组质粒的酶切鉴定45-46
• 4.3.4 褐飞虱翅型分化相关基因flightin与RGSV病毒蛋白之间的互作检测46-47
• 4.4 小结与讨论47-48
• 第五章 亚细胞共定位验证flightin与RGSV-P1,P3,P5各蛋白之间的互作48-57
• 5.1 材料、试剂及仪器48-49
• 5.1.1 褐飞虱48
• 5.1.2 主要试剂48
• 5.1.3 仪器设备48
• 5.1.4 引物设计48-49
• 5.2 方法49-52
• 5.2.1 目的基因pDONR221入门载体的构建49-50
• 5.2.2 pEarly gate101、102瞬时表达载体的构建50
• 5.2.3 重组质粒转化农杆菌50-52
• 5.3 结果与分析52-57
• 5.3.1 基因片段的扩增52
• 5.3.2 基因与pDONR221入门载体的构建52-53
• 5.3.3 pEarly gate101、102瞬时表达载体的构建53-54
• 5.3.4 亚细胞共定位54-57
• 第六章 褐飞虱flightin基因多克隆抗体的制备及应用57-65
• 6.1 材料、试剂及仪器57
• 6.1.1 褐飞虱57
• 6.1.2 主要试剂57
• 6.1.3 仪器设备57
• 6.2 方法57-60
• 6.2.1 Flightin基因的克隆和原核表达载体的构建57-58
• 6.2.2 Flightin蛋白的原核表达及可溶性分析58
• 6.2.3 Flightin重组蛋白的多抗血清制备58-59
• 6.2.4 Western blot检测59
• 6.2.5 抗体效价检测59-60
• 6.3 结果与分析60-63
• 6.3.1 Flightin基因的克隆及原核表达载体pDEST17-flightin的构建60-61
• 6.3.2 目的蛋白的诱导表达及可溶性分析61-62
• 6.3.3 抗血清的制备及Western blot分析62-63
• 6.3.4 Flightin抗体效价检测63
• 6.4 讨论63-65
• 第七章 总结与展望65-67
• 7.1 总结65
• 7.2 展望65-67
• 参考文献67-74
• 附录一 常用培养基的配制74-77
• 附录二 酵母培养基的配制77-79
• 致谢79

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