水稻热激蛋白基因OsDjA6介导的抗稻瘟病功能分析

发布时间：2017-07-19 07:09

  本文关键词：水稻热激蛋白基因OsDjA6介导的抗稻瘟病功能分析

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【摘要】：水稻是我国重要粮食作物。稻瘟病为影响水稻生产三大病害之一,由子囊菌Magnaporthe oryzae引起,每年可造成水稻减产约15%-20%,严重时可达40%-50%,甚至颗粒兀收。因此防控稻瘟病是水稻生产、保障粮食安全的客观需求。热激蛋白为一类大基因家族编码,根据其蛋白分子量分为五类：sHSP、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100。HSP40是一类分子量为40 kDa的sHSP (small HSP, sHSP),已被报道参与植物如烟草、水稻抗病毒反应途径,但针对其与真菌性病害关联研究鲜有报道。本研究挑选水稻接种稻瘟菌之后,经深度转录组学分析的一个表达上调DnaJ (HSP40)基因,构建其RNAi载体并获得了相应转基因株系。从转基因株系中筛选阳性株系,选用转基因纯合株系进行稻瘟菌接种及表型鉴定,探讨其抗性机理,具体结果如下：1、在深度转录组学数据库MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing)中,DnaJ在水稻接种非亲和稻瘟菌小种后12h受诱导表达,而在亲和及空白对照无明显变化,表明DnaJ可能参与水稻抗稻瘟病反应；2、基因序列分析和比对研究表明DnaJ编码一个含有J-domain结构域蛋白,属DnaJ家族type A类别,该基因命名为OsDjA6;3、利用农杆菌介导法,将RNAi载体转化水稻品种泰粳394,获得转基因株系,采用潮霉素抗性基因和nCherry红色荧光检测相结合方法鉴定转基因阳性植株,获得的阳性植株用于后续抗病检测。qRT-PCR鉴定证实OsDjA6表达量在其RNAi转基因阳性株系中明显下调；4、选取转基因纯合株系T2代幼苗,用稻瘟菌小种“RO1-1”孢子悬浮液进行室内喷雾接种,经过三次重复,最终确定了3个独立株系来进行"punch"接种实验,结果证实OsDjA6的RNAi株系对稻瘟菌小种“RO1-1”抗性明显增强；5、检测了经PAMP诱导子flg22和chitin处理OsDjA6的RNAi转基因株系和野生型植株后活性氧积累,结果显示flg22处理后,转基因株系活性氧积累量相对野生型有所提高,而chitin处理之后却没有明显变化,该研究结果表明OsDjA6参与水稻抵抗病原菌PTI的免疫过程调控；6、荧光定量PCR检测显示在OsDjA6 RNAi转基因株系中,三个防御反应相关基因PR5、NH1和WRKY45表达量上调,表明OsDjA6可能通过调控SA信号途径来介导水稻对稻瘟菌的抗性反应。7、水稻原生质体瞬时表达OsDjA6与荧光融合蛋白证实OsDjA6于细胞膜和细胞核,且OsDjA6勺J-domain, ZF-domain等不同结构域不影响其细胞定位；8、为了进一步阐明OsDjA6调节抗稻瘟病的信号通路,本研究以BD-OsDjA6为诱饵蛋白筛选水稻cDNA文库,发现一个C3HC4类型E3泛素连接酶蛋白与OsDjA6在酵母中互作；酵母双杂交表明OsDjA6可在酵母中抑制水稻抗稻瘟病关键调控因子OsSGT1生长。上述结果为深入研究OsDjA6与稻瘟菌分子互作机理奠定了基础；以沉默水稻热激蛋白基因来抵御真菌侵染,为稻瘟病防控、水稻抗性新品种培育提供了新思路。
【关键词】：植物免疫 稻瘟菌 热激蛋白 酵母双杂交
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 摘要4-6
• abstract6-10
• 第1章 绪论10-21
• 1.1 水稻与稻瘟菌10-12
• 1.1.1 稻瘟病危害10
• 1.1.2 稻瘟菌侵染机制10-12
• 1.1.3 稻瘟病防治12
• 1.2 植物免疫12-15
• 1.2.1 植物PTI免疫反应13-14
• 1.2.2 植物ETI免疫防御系统14-15
• 1.3 热激蛋白研究进展15-19
• 1.3.1 热激蛋白分类15-18
• 1.3.2 DnaJ蛋白研究概况18-19
• 1.4 本研究目的与意义19-20
• 1.5 技术路线20-21
• 第2章 OsDjA6 RNAi载体的构建21-33
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 载体菌株21
• 2.1.3 抗生素和限制性内切酶21
• 2.1.4 其它酶,试剂盒,引物合成及测序21
• 2.1.5 其它化学试剂及耗材,仪器21-22
• 2.1.6 培养基22
• 2.1.7 引物设计及序列比对22-23
• 2.1.8 引物信息23
• 2.2 实验方法23-30
• 2.2.1 水稻品种TG394 cDNA序列获得23-25
• 2.2.2 入门载体的构建25-30
• 2.3 结果与分析30-32
• 2.3.1 水稻cDNA的获得30
• 2.3.2 目的基因相关信息的获取30
• 2.3.3 载体构建30-32
• 2.4 讨论32-33
• 第3章 OsDjA6介导的水稻抗病表型鉴定33-44
• 3.1 材料与方法33-37
• 3.1.1 材料33-34
• 3.1.2 方法34-37
• 3.2 结果37-43
• 3.2.1 转基因株系的获取37-38
• 3.2.2 OsDjA6 RNAi转基因阳性基因型鉴定38-39
• 3.2.3 OsDjA6 RNAi转基因纯合株系接种表型鉴定39-40
• 3.2.4 OsDjA6突变体和超表达株系的鉴定40-43
• 3.3 讨论43-44
• 第4章 OsDjA6介导的抗病机理研究44-54
• 4.1 材料与方法44-49
• 4.1.1 材料44-46
• 4.1.2 方法46-49
• 4.2 结果49-52
• 4.2.1 OsDjA6参与调控SA信号反应途径49
• 4.2.2 OsDjA6全细胞定位49-50
• 4.2.3 OsDjA6在酵母中抑制OsSGT1生长50-51
• 4.2.4 OsDjA6与C3HC4 E3在酵母体内发生互作51-52
• 4.3 讨论52-54
• 第5章 全文结论54-56
• 参考文献56-66
• 致谢66-68
• 作者简历68

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1 杨玖霞;水稻热激蛋白基因OsDjA6介导的抗稻瘟病功能分析[D];湖南农业大学;2015年

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本文编号：561671