莲藕酵母双杂交cDNA文库及PPO基因诱饵载体构建

发布时间：2017-07-19 22:13

  本文关键词：莲藕酵母双杂交cDNA文库及PPO基因诱饵载体构建

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【摘要】：莲藕(Nelumbo nucifera),属莲科多年生水生草本植物,具有降脂降压、减缓氧化、防治脂肪肝等药理作用,是一种药食同源的食品。近年来国内外对莲藕需求日益增多,但莲藕在贮藏保鲜和加工过程中存在褐变问题,导致其商品性及营养价值的下降,严重影响了莲藕的出口创汇及医疗效果。研究发现多酚氧化酶(PPO)参与色素的形成过程,是导致莲藕褐变的关键酶之一,也在莲藕抵抗病虫害等过程中发挥了重要的作用。但是目前对PPO的研究主要集中在理化特性方面,有关其基因功能和机理机制的研究还很少。因此,本实验以莲藕为材料,在前人基础上对多酚氧化酶基因进行进一步分子研究,对莲藕酵母文库及PPO基因诱饵载体进行构建,为后续运用酵母双杂交技术揭示莲藕多酚氧化酶的互作蛋白及顺式作用元件奠定基础,以期可以从根源上解决莲藕褐变问题并减少由此产生的经济损失,同时为增强植株抗逆性研究打下基础。通过本研究得到以下结果:1.采用CTAB-LiCl法提取莲藕芽尖总RNA,反转录合成cDNA第一条链并以其为模板进行PCR扩增、胶回收、连接转化、测序等试验得到含有酶切位点NdeI和EcoRI的PPO基因。随后将得到的PPO基因与pGBKT7载体连接得到重组质粒pGBKT7-PPO,在使用双酶切、测序等方法验证重组质粒的准确性之后将诱饵载体与AD共转入AH109菌株中并涂布于SD缺陷型培养基上,发现其在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长,在SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上没有生长说明载体未发生自激活现象。最后挑取成功转入pGBKT7-PPO及pGBKT7的AH109酵母菌株于YPDA液体培养基中培养,两种菌液在600nm波长处的OD值无显著差异,说明诱饵载体对宿主菌AH109未产生毒性,诱饵载体pGBKT7-PPO构建成功。2.本试验采用Smart法构建cDNA文库,首先使用试剂盒分别提取莲藕芽尖、茎、叶的RNA,得到高质量的RNA后将三者等质量混合得到完整的莲藕植株RNA,通过反转录及LD-PCR等方法合成ds cDNA并纯化,获得片段大小在500bp-3000bp范围内的ds cDNA,将纯化后的ds cDNA与p GADT连接并转化构建cDNA文库。最后对cDNA文库进行质量及污染检测,根据试验计算可知得到的cDNA文库的库容量为7.5×106cfu,文库滴度为7.5×1010 cfu/mL,转化效率为2.5×106 cfu/μg,同时涂板检测到收集的cDNA文库菌液没有污染,表明cDNA文库构建成功,能够满足筛选目的蛋白及保存的需要。
【关键词】：莲藕 PPO 酵母双杂交 诱饵载体 cDNA文库
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S645.1;Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-22
• 1.1 莲藕12-14
• 1.1.1 莲藕概况12-13
• 1.1.2 莲藕食用及药用价值13-14
• 1.2 多酚氧化酶概述14-18
• 1.2.1 PPO基本情况14
• 1.2.2 PPO的定位与分布14-15
• 1.2.3 PPO的结构15-16
• 1.2.4 PPO的生理作用16
• 1.2.5 酶促褐变机理16-17
• 1.2.6 PPO活性抑制方法概述17-18
• 1.3 酵母双杂交系统18-22
• 1.3.1 酵母双杂交系统概述18
• 1.3.2 酵母双杂交系统的完善18-19
• 1.3.3 酵母双杂交系统的应用19-22
• 第二章 试验方案22-24
• 2.1 研究目的及意义22
• 2.2 研究内容与技术路线22-24
• 2.2.1 研究内容22-23
• 2.2.2 技术路线23-24
• 第三章 莲藕酵母双杂交诱饵载体PGBKT7-PPO的构建与检测24-37
• 3.1 材料与方法24-26
• 3.1.1 植物材料24
• 3.1.2 菌株及质粒24
• 3.1.3 常用试剂及试剂盒24
• 3.1.4 引物合成与测序24
• 3.1.5 常用试剂及培养基的配制24-25
• 3.1.6 主要仪器设备25-26
• 3.2 试验方法26-31
• 3.2.1 莲藕芽尖总RNA的提取（CTAB法）26
• 3.2.2 cDNA第一条链合成（反转录试剂盒）26-27
• 3.2.3 对合成的cDNA质量进行初步检测27
• 3.2.4 目的基因的克隆27-28
• 3.2.5 目的片段与T-vector PMD19（simple）的连接28
• 3.2.6 连接产物的转化28-29
• 3.2.7 菌落PCR检测29
• 3.2.8 诱饵载体构建29-31
• 3.3 结果分析31-35
• 3.3.1 RNA提取31
• 3.3.2 cDNA质量检测结果31
• 3.3.3 莲藕PPO基因PCR扩增结果31-32
• 3.3.4 PMD19-T-PPO（simple）测序结果32-33
• 3.3.5 提取PMD19-T-PPO（simple）及pGBKT7质粒与双酶切结果33-34
• 3.3.6 诱饵质粒pGBKT7-PPO提取及双酶切鉴定结果34
• 3.3.7 AH109中重组子PGBKT7-PPO的毒性检测及自激活试验34-35
• 3.4 讨论35-37
• 第四章 莲藕CDNA文库的构建37-45
• 4.1 材料与方法37-38
• 4.1.1 植物材料37
• 4.1.2 菌株及质粒37
• 4.1.3 常用试剂及试剂盒37
• 4.1.4 常用试剂及培养基的配制37
• 4.1.5 引物37-38
• 4.1.6 主要仪器设备38
• 4.2 试验方法38-41
• 4.2.1 整株莲藕RNA提取方法38
• 4.2.2 cDNA的合成38-40
• 4.2.3 酵母双杂交文库的构建40-41
• 4.3 结果与分析41-44
• 4.3.1 整株莲藕RNA提取结果41
• 4.3.2 ds cDNA的合成及纯化结果41-43
• 4.3.3 cDNA文库构建及质量检测43-44
• 4.4 讨论44-45
• 第五章 结论45-46
• 参考文献46-56
• 附录 156-58
• 附录 258-59
• 缩略词59-60
• 致谢60-61
• 作者简介61

【参考文献】

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本文编号：565071