鸭疫里默氏菌GroEL和GroES蛋白生物活性及不同应激条件对其表达量的影响

发布时间：2017-07-20 22:13

  本文关键词：鸭疫里默氏菌GroEL和GroES蛋白生物活性及不同应激条件对其表达量的影响

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【摘要】：热休克蛋白GroEL蛋白和其辅助伴侣蛋白GroES蛋白作为热休克蛋白家族中的重要成员,在细菌抵抗外界不良环境时发挥着重要作用。本文对鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)的GroEL蛋白和其辅助因子GroES蛋白基因进行了克隆、表达和纯化,检测了GroEL和GroES蛋白的生物活性以及不同应激条件对其表达水平的影响。研究结果如下：1. GroEL和GroES基因的原核表达及GroEL-GroES融合表达以RA CH-1株基因组为模板,通过PCR扩增出GroEL和GroES基因片段,并克隆到pMD19-T载体上。利用原核表达系统pET-28a(+)表达重组蛋白GroEL和GroES,采用亲和层析法纯化得到GroEL和GroES重组蛋白。经过SDS-PAGE分析两种蛋白的分子量约为65 kDa和15 kDa。通过分别扩增RA GroEL和GroES基因,然后运用重叠PCR将GroEL和GroES基因通过Linker连接构建得到融合基因GroEL-GroES,将其定向克隆到pMD19-T载体上。再将GroEL-GroES目的基因定向插入pET-28a(+)原核表达系统,通过SDS-PAGE分析,融合表达的GroEL-GroES蛋白分子量约为70kD。2. GroEL和GroES蛋白同源模建与分析及活性研究基于同源模建软件Modeller预测了GroEL和GroES蛋白的三维结构,所预测的蛋白结构合理性采用Procheck软件进行评估。结果显示GroEL和GroES蛋白模建后的结构均能与模板能很好的叠合。用Autodock4.0软件将GroEL结构模型与ATP进行自动对接,分析二者之间的相互作用,发现ATP的嘌呤环能够伸入GroEL蛋白由氨基酸残基ALA-2, LEU-524和PRO-525所组成的疏水性腔袋,同时ATP三磷酸基团分别与氨基酸残基ASP-4和ILE-5形成氢键,GroEL可与ATP形成稳定的复合物。本试验分别测定了GroEL和GroEL-GroES蛋白在15-70℃的ATP酶活性,发现GroEL和GroEL-GroES蛋白在55℃左右时酶活性最高,且活性随温度变化而变化,但GroEL和GroEL-GroES蛋白的酶活性无显著性差异。GroES在30-55℃时能够提高GroEL的ATP酶活性,但在55℃后对GroEL的ATP酶活性无明显影响。3.不同应激条件对GroEL和GroES基因表达量的影响通过RT-qPCR技术,对不同应激环境条件下RA CH-1株GroEL和GroES基因表达量变化进行比较。结果显示,在不同热激温度下,GroEL和GroES基因表达量随热激温度的升高而升高。在55℃热激时,GroEL和GroES基因的表达量达到最高,GroEL和GroES基因分别上调了3.59倍和3.62倍,差异显著(P0.05)。在低浓度H202浓度(1.25%和2.5%)条件下,GroEL基因表达量明显上调,其表达量分别为对照组的2.45倍和2.22倍(P0.05)。GroES基因仅在1.25%浓度条件下,相对表达量明显升高,其表达量为对照组的2.62倍(P0.05),但在2.5%浓度条件下,表达量下调,差异不显著(P0.05)。在高浓度H2O2(5%)作用下,GroEL和GroES基因表达量均受到抑制(P0.05)。不同pH对RA作用10min后均引起GroEL和GroES基因mRNA的表达水平的变化。在酸性条件(pH=3)下,GroEL和GroES基因mRNA的表达量,分别为对照组(pH=7)的2.105倍和4.683倍(P0.05)。在碱性条件(pH=10), GroEL和GroES基因mRNA的表达量分别上调了4.8%和51.3%,但与对照组相比,差异不显著(P0.05)。结果表明,酸性环境显著影响GroEL和GroES基因的表达量,而碱性环境对GroEL和GroES基因的表达量无明显影响。在低盐浓度(3%)条件下,与普通TSB培养基比较,GroEL和GroES基因在含有3%NaCl TSB培养基中受到诱导,表达上调,表达差异显著(P0.05); GroEL和GroES基因在含有6%NaCl TSB培养基中表达量下降,且GroES基因下降明显(P0.05)。
【关键词】：鸭疫里默氏菌 GroEL GroES ATPase酶活性 应激
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 英文缩写词汇7-10
• 第一部分 文献综述10-16
• 1 鸭疫里默氏菌的概述10-11
• 2 GroEL和GroES研究进展11-15
• 2.1 热休克蛋白概述11-12
• 2.2 GroEL和GroES的基本结构12-13
• 2.3 GroEL和GroES的生物学功能13-15
• 3 本研究的目的意义15-16
• 第二部分 试验研究16-54
• 1 试验材料16-19
• 1.1 菌株及载体16
• 1.2 主要试剂16
• 1.3 主要试剂的配制16-18
• 1.4 仪器与器材18-19
• 2 试验方法19-31
• 2.1 鸭疫里默氏菌GroEL和GroES基因克隆及生物信息学分析19-21
• 2.2 鸭疫里默氏菌GroEL-GroES融合表达质粒的构建21-23
• 2.3 GroEL、GroES和GroEL-GroES蛋白的表达及纯化23-25
• 2.4 GroEL和GroES重组蛋白生物活性的研究25-28
• 2.5 不同应激条件对RA GroEL和GroES基因表达量的影响28-31
• 3 结果31-50
• 3.1 GroEL和GroES基因克隆、原核表达及纯化31-36
• 3.2 GroEL-GroES串联基因的克隆、原核表达及纯化36-38
• 3.3 GroEL和GroES蛋白生物活性检测38-44
• 3.4 不同应激条件对RA GroEL和GroES基因表达量的影响44-50
• 4 讨论50-53
• 5 结论53-54
• 参考文献54-60
• 致谢60-61
• 攻读学位期间发表的学术论文61

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