枸橼C-05抗溃疡病防御相关基因的鉴定与表达分析

发布时间：2017-07-20 14:16

  本文关键词：枸橼C-05抗溃疡病防御相关基因的鉴定与表达分析

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【摘要】：柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker disease, CBCD)是由柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri, Xac)引起的一种世界性检疫病害,危害严重,防治困难,对于非疫区要严格禁止携带溃疡病菌的柑橘材料的流入,加强对柑橘溃疡病菌的检测。但这只是治标不治本,要从根本上解决问题,急需找到抗病柑橘资源、培育抗病品种。枸橼C-05是由国家柑橘改良中心长沙分中心经过多年筛选,最终确定的对溃疡病菌表现过敏反应的独有抗病种质。探讨枸橼C-05的抗病机理,有望挖掘抗病相关基因,为抗病分子育种提供基因资源和理论指导,进而实现柑橘抗溃疡病育种的突破,解决这一产业难题。本研究以柑橘溃疡病抗病种质枸橼C-05对比感病种质冰糖橙在接种溃疡病菌后的转录组数据为基础,依据本实验室GO功能分类、pathway代谢通路分析的结果锁定了几个可能与柑橘溃疡病抗病相关的候选基因。对候选基因的蛋白结构与功能作了生物信息学分析,采用定量PCR技术分析了这几个基因在接种flg22溶液或不同浓度的溃疡病菌液后的抗、感病柑橘材料中的表达模式,同时也对qPCR技术检测柑橘溃疡病菌的灵敏度进行了摸索。主要研究结论如下：1.在响应溃疡病菌侵染的过程中,FLS2在注射接种和喷雾接种后都表现枸橼C-05中的上调表达阶段对应冰糖橙中的下调表达；EFR在注射接种后的枸橼C-05和冰糖橙中均上调表达,且趋势非常接近,但在喷雾接种后表现枸橼C-05中的上调表达阶段对应冰糖橙中的下调表达；BAK1在注射接种后的枸橼C-05和冰糖橙中均上调表达,在喷雾接种后的枸橼C-05和冰糖橙中均下调表达,且趋势非常接近。2.在响应flg22的过程中,4个柑橘防御相关候选基因FLS2、BAK1、CERK1和LYP2在注射接种后的抗病材料枸橼C-05和感病材料冰糖橙中,均受诱导而表现差异表达,表现为枸橼C-05中的上调表达阶段对应冰糖橙中的下调表达,只是存在量的差异及枸橼C-05出现表达峰值的时间点的差异,说明flg22在叶肉中具有PAMP作用,且其对FLS2和BAK1的诱导效率和强度比溃疡病菌高,但对CERK1和LYP2没有太大作用。4个基因在喷雾接种后的两种柑橘材料中,都表现下调表达,且趋势非常接近,可以认为flg22在叶表对这几个基因的表达不起诱导作用。3. qPCR检测柑橘溃疡病菌的灵敏度分析表明,qPCR检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度比常规PCR高10～1000倍,且常规PCR对柑橘溃疡病菌DNA的检测会受到植物DNA的影响,qPCR不受植物DNA影响；对低菌量接种的冰糖橙样品进行分析,qPCR即时就能检测到柑橘溃疡病菌,并能观察到柑橘溃疡病菌先慢后快的增殖趋势,而常规PCR要接种后2d才能检测到柑橘溃疡病菌,该技术适用于溃疡病菌量对基因表达影响的研究。在用不同浓度的溃疡病菌液对两种柑橘材料实施接种后,低浓度接种时细菌增殖的速度比高浓度接种时更快,溃疡病菌在冰糖橙中增殖的速度比在枸橼C05中更快。本研究分析的3个假定的柑橘防御相关基因FLS2、 EFR和BAKl在抗病材料枸橼C-05和感病材料冰糖橙中,均受溃疡病菌的诱导而表现差异表达,表现为枸橼C-05中的上调表达时间点对应冰糖橙中的下调表达。在接种浓度为1010cfu/ml时枸橼C-05中这三个基因的表达量均较另两个接种浓度高,在接种浓度为108cfu/ml时冰糖橙中这三个基因的表达量较另两个接种浓度低。
【关键词】：柑橘 抗病相关基因 定量PCR 表达分析 检测
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.66
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 植物先天免疫系统研究进展11-20
• 1.1.1 PAMPs引发的生理反应12-15
• 1.1.2 PTI反应中的早期信号机制15-20
• 1.2 柑橘溃疡病菌检测的研究现状20-22
• 1.3 研究目的及意义22-23
• 第二章 溃疡病菌侵染后枸橼C-05中防御相关候选基因的表达分析23-34
• 2.1 材料与方法23-26
• 2.1.1 植物材料23
• 2.1.2 供试菌种23
• 2.1.3 溃疡病菌液的制备23-24
• 2.1.4 活体接种与样品采集24
• 2.1.5 样品总RNA的提取24-25
• 2.1.6 cDNA的合成25
• 2.1.7 防御候选基因序列检索及引物合成25-26
• 2.1.8 候选基因的生物信息学分析26
• 2.1.9 引物特异性验证及基因表达分析26
• 2.2 结果与分析26-31
• 2.2.1 接种后的症状观察26-27
• 2.2.2 防御相关候选基因蛋白结构分析及功能预测27-28
• 2.2.3 防御相关候选基因引物特异性验证28
• 2.2.4 候选基因对溃疡病菌侵染的响应28-31
• 2.3 讨论31-33
• 2.4 小结33-34
• 第三章 flg22对枸橼C-05中防御相关候选基因表达的诱导34-42
• 3.1 材料与方法34-37
• 3.1.1 植物材料34
• 3.1.2 flg22多肽34
• 3.1.3 flg22多肽处理液的制备34
• 3.1.4 活体接种与样品采集34-35
• 3.1.5 样品RNA的提取35-36
• 3.1.6 cDNA的合成36
• 3.1.7 基因表达分析36-37
• 3.2 结果与分析37-39
• 3.2.1 接种后的症状观察37
• 3.2.2 候选基因对flg22的响应37-39
• 3.3 讨论39-41
• 3.4 小结41-42
• 第四章 溃疡病菌浓度对防御相关候选基因表达的影响42-54
• 4.1 材料与方法42-44
• 4.1.1 植物材料42
• 4.1.2 供试菌种42
• 4.1.3 溃疡病菌液的制备42
• 4.1.4 活体接种与样品采集42-43
• 4.1.5 基因组DNA的提取43
• 4.1.6 qPCR检测溃疡病菌的反应程序43
• 4.1.7 常规PCR检测溃疡病菌的反应程序43-44
• 4.2 结果与分析44-52
• 4.2.1 PCR检测柑橘溃疡病菌DNA的灵敏度分析44-46
• 4.2.2 PCR检测柑橘溃疡病菌量的灵敏度分析46-48
• 4.2.3 利用PCR对冰糖橙接种后进行动态监测48-49
• 4.2.4 不同浓度的溃疡病菌液对柑橘抗溃疡病防御相关基因的诱导分析49-52
• 4.3 讨论52-53
• 4.4 小结53-54
• 总结与展望54-55
• 参考文献55-61
• 附录61-65
• 致谢65-66
• 个人简历66

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本文编号：568436