抗无乳链球菌中药的筛选及盐酸小檗碱抗无乳链球菌作用机理的初步研究

发布时间：2017-07-26 23:04

  本文关键词：抗无乳链球菌中药的筛选及盐酸小檗碱抗无乳链球菌作用机理的初步研究

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【摘要】：无乳链球菌是奶牛乳房炎的致病菌之一,患有乳房炎的奶牛会影响牛奶的产量和品质,目前奶牛乳房炎的主要治疗手段是使用抗生素疗法,但抗生素易使细菌产生耐药性,影响治疗效果。中草药具有不易产生耐药性、高效低毒、低残留的优势。因此本研究对20味中药的有效成分进行提取,筛选出抗无乳链球菌最优的中药,对其单味中药进行提取工艺的优化,在最佳提取工艺条件下,研究黄连提取物对引致奶牛乳房炎的主要致病菌的体外抑菌活性,然后以抑菌效果最优的中药有效成分的单体物质为研究对象,进行抗无乳链球菌的抑菌机理的初步研究。主要研究内容如下：1抗无乳链球菌中药的筛选：采用乙醇回流法和超声波法提取20味中药的有效成分,测定黄连等20味中药提取物对无乳链球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。20味中药提取物的体外抗菌活性结果表明：黄连、虎杖、地榆和黄芩4味中药提取物的MIC值和MBC值范围为78mg/mL～15.625mg/mL;蒲公英、乌梅、茵陈、秦皮、艾叶和紫花地丁6味中药提取物的MIC值范围为3125mg/mL～62.5mg/mL, MBC值范围为62.5mg/mL～125mg/mL;黄柏、鱼腥草和白头翁3味中药提取物的MIC值和MBC值均为125mg/mL;苦参、金银花、穿心莲、杜仲、连翘、夏枯草和何首乌7味中药提取物的MIC值和MBC值范围为25 0mg/mL～500mg/mL。结论：筛选出黄连提取物对无乳链球菌具有最好的体外抑菌效果。2黄连抗无乳链球菌的最优提取工艺及体外抑菌活性研究：采用正交设计,以浸膏得率及对无乳链球菌的最低抑菌浓度(MIC)值和最低杀菌浓度(MBC)为指标,对黄连提取工艺条件进行优选研究,在黄连的最佳提取工艺条件下,测定黄连提取物对奶牛乳房炎的主要致病菌即无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值。最佳提取工艺结果表明,黄连的最佳提取工艺为料液比1：8,80%乙醇浓度回流提取2次,每次1.5h。黄连体外抑菌活性实验结果表明,黄连提取物对无乳链球菌的MIC值和MBC值均为39mg/mL,对大肠杆菌的MIC值和MBC值分别为62.5mg/mL和125mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值均为3125mg/mL。结论：在最佳提取工艺下的黄连提取物抑菌效果提高,且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用。3盐酸小檗碱对无乳链球菌形态结构及乳酸脱氢酶活性的影响：利用平板稀释法绘制出盐酸小檗碱对无乳链球菌的抑菌曲线,通过透射电子显微镜观察盐酸小檗碱对无乳链球菌超微结构的影响,测定乳酸脱氢酶(LDH)活力研究盐酸小檗碱对无乳链球菌酶活性的影响。抑菌曲线结果表明,在MIC浓度下,盐酸小檗碱能够抑制细菌的生长；在2MIC浓度下,盐酸小檗碱能在4h内将细菌全部杀死。透射电镜结果表明,正常组无乳链球菌细胞结构清晰完整,从内到外可见层次分明的核区,细胞膜和细胞壁。在盐酸小檗碱的作用下,细胞形状变得不规则,细胞膜、细胞壁逐渐溶解,膜壁界限变得模糊,细胞质严重外流,核区不清晰,细胞质解体内出现空腔。测定酶活力实验结果表明,经过药物作用后,乳酸脱氢酶活力下降。结论：盐酸小檗碱对无乳链球菌的抑菌曲线呈现了浓度时间的相关性。盐酸小檗碱对无乳链球菌的结构有较强的破坏作用,随着时间的延长破坏加剧,且可以降低乳酸脱氢酶的活性。4盐酸小檗碱对无乳链球菌蛋白质和DNA的影响：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核酸荧光染色法研究盐酸小檗碱对无乳链球菌蛋白质和DNA的影响。SDS-PAGE结果表明,正常无乳链球菌蛋白谱带多且清晰,而经药物作用后,蛋白谱带变浅,有的谱带甚至消失；DAPI染色实验结果表明,正常无乳链球菌DNA荧光强度较强,且荧光点较多,经过药物作用后DNA荧光强度明显减弱。结论：盐酸小檗碱可以影响蛋白质和DNA的合成。
【关键词】：无乳链球菌 盐酸小檗碱 抑菌活性 抑菌机理
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S853.7
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略词表9-14
• 第一章 文献综述及研究目的意义14-24
• 1 文献综述14-23
• 1.1 无乳链球菌研究概况14-15
• 1.1.1 无乳链球菌的病原学和流行病学14
• 1.1.2 无乳链球菌的致病危害及致病机理14-15
• 1.1.3 奶牛乳房炎的临床症状及病理变化15
• 1.2 奶牛乳房炎的防治现状15-17
• 1.2.1 抗菌药物治疗15
• 1.2.2 中草药治疗15-16
• 1.2.3 抗生素和中草药结合治疗16
• 1.2.4 生物制剂治疗16-17
• 1.3 天然药物抗菌研究进展17-18
• 1.4 天然药物中抗菌有效成分的研究进展18-19
• 1.5 天然药物抗菌机理的研究进展19-21
• 1.5.1 干扰细菌细胞壁的形成和细胞膜的通透性19
• 1.5.2 影响细菌蛋白质合成19-20
• 1.5.3 干扰微生物的酶系,破坏其正常的新陈代谢,抑制酶的活性20
• 1.5.4 对细菌呼吸代谢的抑制20
• 1.5.5 对细菌生长曲线的影响20-21
• 1.5.6 对细菌DNA、RNA含量的影响21
• 1.6 黄连及盐酸小檗碱研究进展21-23
• 1.6.1 抗肿瘤作用21-22
• 1.6.2 降血脂作用22
• 1.6.3 降血糖作用22
• 1.6.4 抗微生物作用22-23
• 2 研究目的与意义23-24
• 第二章 抗无乳链球菌中药的筛选24-31
• 1 材料与方法24-28
• 1.1 材料24-25
• 1.1.1 菌株24
• 1.1.2 药材24
• 1.1.3 培养基及试剂24-25
• 1.1.4 主要仪器设备25
• 1.2 方法25-28
• 1.2.1 中药的提取25-27
• 1.2.2 细菌菌悬液的制备27
• 1.2.3 20味中药提取物对无乳链球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)27-28
• 2 结果与分析28-29
• 2.1 20味中药提取物对无乳链球菌的体外抑菌活性研究28-29
• 3 讨论29-31
• 第三章 黄连抗无乳链球菌的最优提取工艺及体外抑菌活性研究31-38
• 1 材料与方法31-34
• 1.1 材料31-32
• 1.1.1 菌种31
• 1.1.2 仪器设备与试剂31-32
• 1.1.3 培养基32
• 1.2 方法32-34
• 1.2.1 黄连提取工艺的正交试验设计32-33
• 1.2.2 正交试验黄连的体外抑菌活性33
• 1.2.3 黄连最佳提取工芝下的体外抑菌活性33-34
• 2 结果与分析34-36
• 2.1 黄连最佳提取工艺的优选34-35
• 2.2 最佳提取工艺下黄连对3种细菌的体外抑菌活性研究35-36
• 3 讨论36-38
• 第四章 盐酸小檗碱对无乳链球菌形态结构及乳酸脱氢酶活性的影响38-45
• 1 材料与方法38-40
• 1.1 材料38-39
• 1.1.1 菌种及培养基38
• 1.1.2 药物38
• 1.1.3 主要仪器38-39
• 1.1.4 试剂39
• 1.2 方法39-40
• 1.2.1 盐酸小檗碱药物的制备39
• 1.2.2 菌悬液的制备39
• 1.2.3 盐酸小檗碱对无乳链球菌的MIC39
• 1.2.4 抑菌曲线的绘制39-40
• 1.2.5 透射电镜样品的制备及观察40
• 1.2.6 测定无乳链球菌LDH40
• 2 结果与分析40-42
• 2.1 盐酸小檗碱对无乳链球菌的MIC40
• 2.2 盐酸小檗碱对无乳链球菌的抑菌曲线40-41
• 2.3 盐酸小檗碱对无乳链球菌超微结构的影响41
• 2.4 盐酸小檗碱对无乳链球菌LDH的影响41-42
• 3 讨论42-45
• 第五章 盐酸小檗碱对无乳链球菌蛋白质和DNA的影响45-50
• 1 材料与方法45-46
• 1.1 材料45-46
• 1.1.1 菌种及培养基45
• 1.1.2 药物及试剂45
• 1.1.3 主要仪器设备45-46
• 1.2 方法46
• 1.2.1 盐酸小檗碱药液的制备46
• 1.2.2 菌悬液的制备46
• 1.2.3 SDS-聚丙酰胺凝胶电泳46
• 1.2.4 盐酸小檗碱对无乳链球菌DNA荧光强度变化的影响46
• 2 结果与分析46-48
• 2.1 SDS-聚丙酰胺凝胶电泳结果46-47
• 2.2 盐酸小檗碱对无乳链球菌DNA荧光强度变化的影响47-48
• 3 讨论48-50
• 第六章 结论与创新50-52
• 1 结论50
• 2 创新50-52
• 参考文献52-61
• 致谢61-62
• 附图62-65
• 攻读学位期间发表的学术论文65

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本文编号：578750