华重楼内生菌的分离鉴定与代谢产物研究

发布时间：2017-07-30 17:22

  本文关键词：华重楼内生菌的分离鉴定与代谢产物研究

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【摘要】：华重楼(Paris polyphylla Var. chinensis Franch)为延龄草科(Trilliaceae)重楼属植物,是一种多年生草本名贵中药,具有清热解毒,消肿止痛,凉肝定惊等功效,主要用于疔疮痈肿,咽喉肿痛,蛇虫咬伤,跌扑伤痛,惊风抽搐等病症,被《中国药典》(2010年版)收录。现代药理研究表明,重楼具有止血止痛、抗菌抗癌、祛痰镇静,因此成为了云南白药、抗病毒颗粒、宫血宁胶囊等多种中成药的主要成分。然而由于重楼自然生长缓慢,从种子萌发到成熟收获需要8—10年的时间,加之人工种植技术尚未成熟,暂时还没有大规模的开发和利用,重楼生物量整体上面临着短缺；更由于市场需求的巨大利益诱惑,大量的野生资源被农户采挖,让野生重楼资源日渐枯竭。所以寻找重楼的替代品和开发人工种植技术成为了目前研究的重点和热点。参考国内外的研究文献,植物内生菌能够产出与宿主相同或者相似的具有一定生理活性的次级代谢产物,而从菌类中提取有用的代谢产物是进行工厂化规模化生产的最好途径。本文以四川邛崃山脉的华重楼内生菌为研究材料,寻找可以产生甾体皂苷或者类似物的菌种,首先从实验室的层面发现和解决重楼资源不足的问题。从四川都江堰市、宝兴县、雨城区、名山县、天全县采集新鲜的人工栽培华重楼,利用组织切块法进行内生真菌和内生细菌的分离、纯化和鉴定。共分离内生真菌83株,纯化52株,ITS分子鉴定出26株,分为7个属；分离内生细菌101株,纯化48株,16 SrDNA分子鉴定出35株,分为16个属。对内生菌的进行发酵液超声波破碎、萃取、旋转蒸发后HPLC检测,同重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ及薯蓣皂苷元的标准品色谱图进行比对,发现4株真菌(DJY—10、DJY—7、MS—9、BX—15)和3株细菌(BX—9、YC—3、MS—6)至少有1个和标准品出峰时间相近,其中DJY—7、MS—9、BX—15、YC—3和重楼皂苷Ⅰ的出峰时间相近,YC—3和重楼皂苷Ⅱ的出峰时间相近,BX—15、YC—3、MS—6和重楼皂苷Ⅵ的出峰时间相近,BX—15和重楼皂苷Ⅶ的出峰时间相近,7株内生菌都和薯蓣皂苷元的出峰时间相近。而真菌BX—15和细菌YC—3都和5个标准品的其中4个有相近的出峰时间,这可能成为利用内生菌进行重楼替代生产的优良菌株。根据分子鉴定结果,DJY-10和MS-9为尖胞镰刀属、DJY-7为木霉属、BX—9为苍白杆菌属、YC—3为芽孢杆菌属、MS—6为绿脓假单胞菌属,BX—15由于在测序过程中出现了结合问题尚未鉴定出。在镰刀属、芽孢杆菌属和假单胞菌属中已有研究发现了可以产甾体皂苷的重楼内生菌,在木霉属、苍白杆菌属中是首次发现可以产甾体皂苷的重楼内生菌,这表明重楼内生菌的研究还需要进一步更全面的探索。
【关键词】：华重楼 内生菌 代谢产物 甾体皂苷
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.239
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 文献综述11-20
• 1.1 植物内生菌相关研究11-16
• 1.1.1 植物内生菌的定义11
• 1.1.2 植物内生菌的分布11-12
• 1.1.3 植物内生菌的种类12-13
• 1.1.3.1 内生真菌12
• 1.1.3.2 内生细菌12
• 1.1.3.3 内生放线菌12-13
• 1.1.4 植物内生菌的生物学应用13-14
• 1.1.4.1 固氮作用13
• 1.1.4.2 促进植物生长发育13-14
• 1.1.4.3 增强宿主的抗逆性14
• 1.1.5 次级代谢产物的开发和利用14-16
• 1.1.5.1 抗菌类物质14-15
• 1.1.5.2 抗癌类物质15
• 1.1.5.3 杀虫类物质15-16
• 1.1.5.4 酶类活性物质16
• 1.1.5.5 植物生长激素16
• 1.2 重楼相关研究及现状分析16-18
• 1.2.1 重楼的形态特征16-17
• 1.2.2 重楼的主要化学成分17
• 1.2.3 重楼的药理活性及应用17-18
• 1.3 重楼内生菌研究现状18-19
• 1.3.1 重楼内生菌的多样性研究18
• 1.3.2 重楼内生菌抗菌活性研究18-19
• 1.3.3 重楼内生菌次级代谢产物研究19
• 1.4 本研究的目的和意义19-20
• 2 材料与方法20-27
• 2.1 材料、试剂与主要仪器20-21
• 2.1.1 材料20
• 2.1.2 主要试剂20-21
• 2.1.3 主要仪器21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 培养基配制及处理21-22
• 2.2.1.1 马铃薯琼脂培养基PDA21
• 2.2.1.2 牛肉膏蛋白胨培养基NA21-22
• 2.2.2 真菌发酵液培养基PD22
• 2.2.3 细菌发酵液培养基NA22
• 2.2.4 华重楼块茎的处理及内生菌的分离、纯化22
• 2.2.5 华重楼内生菌发酵液培养22-23
• 2.2.6 华重楼内生菌菌种鉴定23-26
• 2.2.6.1 内生菌基因组DNA提取23-25
• 2.2.6.2 PCR扩增25
• 2.2.6.3 琼脂糖电泳检测25-26
• 2.2.6.4 序列分析26
• 2.2.7 华重楼内生菌代谢产物研究26-27
• 2.2.7.1 发酵液处理26-27
• 2.2.7.2 标准品的制备27
• 2.2.7.3 HPLC检测27
• 3 结果与分析27-39
• 3.1 华重楼内生菌的分离纯化27-29
• 3.1.1 内生真菌的分离纯化27-28
• 3.1.2 内生细菌的分离纯化28-29
• 3.2 华重楼内生菌的菌种鉴定29-36
• 3.2.1 PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳检测29-30
• 3.2.2 测序结果30
• 3.2.3 构建系统发育树30-36
• 3.3 华重楼内生菌代谢产物的鉴定36-39
• 3.3.1 标准品的HPLC检测图谱36-37
• 3.3.2 样品的HPLC检测图谱37-39
• 4 讨论39-42
• 参考文献42-47
• 致谢47-48
• 附录48-51

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本文编号：595343