猪源杀菌通透性增加蛋白N端基因的克隆原核表达及抗菌活性测定

发布时间：2017-07-31 11:23

  本文关键词：猪源杀菌通透性增加蛋白N端基因的克隆原核表达及抗菌活性测定

  更多相关文章： 猪源杀菌通透性增加蛋白 BPI-N蛋白 纯化 抑菌 原核表达

【摘要】：随着当代社会出现了大量抗生素的滥用,药物残留现象已经变得越来越严重。杀菌通透性增加蛋白(BPI)以其作为一种具有天然的防御功能的一种新型物质出现。其特点是具有广谱的抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫等方面的生物学特性。并且具有细菌不容易产生耐药性的特点而被人们寄希望于在未来能够取代抗生素,作为一种新型药物出现。猪源杀菌通透性增加蛋白(BPI)作为一种来自于猪中性粒细胞中分离得到的一种抗菌活性物质。其中,起主要杀菌作用的为猪源杀菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因,一般由200～240个氨基酸组成。大多数的革兰阴性菌对BPI-N端蛋白非常的敏感,并且,BPI-N蛋白对少部分的革兰阳性菌也具有一定的抗菌活性。本实验通过利用基因工程技术对BPI-N端基因进行克隆表达以及抗菌活性的研究。为以后猪源杀菌通透性增加(BPI) N端蛋白的实际生产以及应用提供一定理论基础。1、BPI-N端基因的扩增根据NCBI上已发表的猪源杀菌通透性增加蛋白(BPI)基因序列,利用软件,分析得出了猪源杀菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因序列。再利用DNAstar、 Primer 5以及Oligo等软件,设计了两条猪源杀菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因的扩增引物P1、P2,并加入肠激酶切割位点,为后期肠激酶作用提供靶向引导,以防表达产物被组氨酸标签包裹而不具有抗菌活性。从猪的肝脏中抽提RNA,进行扩增。将其插入pMD19-T载体上进行测序。所获序列与已发表的猪源杀菌通透性增加蛋白(BPI) N端基因序列(GenBank ID:NM_001159307.1)完全相同。2. BPI-N端基因在大肠杆菌中的克隆、表达通过利用Primer 5分析软件选取了Bam HI和XhoI两个酶切位点。利用BamHI和XhoI分别将含有BPI-N的目的基因重组质粒pMD19-T-BPI-N和表达载体pET-32a进行双酶切后,回收、纯化。连接构建成原核表达质粒,将其命名为pET-32a-BPI-N。将重组质粒pET-32a-BPI-N转化入DH5 a中进行筛选,同时进行PCR和单双酶切鉴定,鉴定成功后,提取重组质粒pET-32a-BPI-N。将其转化入大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG(浓度大约1.5M)诱导。使其表达BPI-N蛋白。通过SDS-PAGE鉴定以及对表达条件的优化,表明pET-32a-BPI-N已经在大肠杆菌中获得了高效的表达,SDS-PAGE结果显示表达产物的分子量大约为47.0KD。在上清中表达含量较高。为了测定BPI-N蛋白的活性。将BPI-N蛋白进行镍离子柱亲和层析。从而得到纯度较高的融合蛋白。经过肠激酶切割,去掉组氨酸标签后,获得分子量大约26.0KD左右的BPI-N端蛋白。3、猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)进行抗菌活性研究将经过纯化切割以后的猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)进行抗菌活性以及其稳定性的研究。结果表明：猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)对实验的革兰阴性菌都具有抗菌活性。对少数的革兰阳性菌也具有抗菌活性。紫外光照射对猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)的抗菌活性有一定的影响,但影响十分微弱。过酸、过碱的条件下会严重影响其抗菌活性,中性条件时,BPI-N蛋白的抗菌活性最强。对温度的要求较高,当处于80℃环境下15min后,将会失去抗菌活性。
【关键词】：猪源杀菌通透性增加蛋白 BPI-N蛋白 纯化 抑菌 原核表达
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 文献综述12-25
• 1.1 嗜中性多形核粒细胞(PMNs)的作用机制以及内源性抗菌肽的简介13-14
• 1.1.1 嗜中性多形核粒细胞(PMNs)的作用机制13-14
• 1.1.2 (PMNs)抗菌肽的简介14
• 1.2 杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的分布及特点14-16
• 1.2.1 杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的分布14-15
• 1.2.2 杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的特点15
• 1.2.3 杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的作用机理15-16
• 1.3 杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的组成及结构16-18
• 1.3.1 杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的组成16
• 1.3.2 杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的结构16-18
• 1.4 BPI在生物学活性方面的研究18-24
• 1.4.1 BPI在杀灭GNB方面的作用18-19
• 1.4.2 BPI在中和内毒素方面的作用19-21
• 1.4.3 BPI在抗真菌方面的应用前景21-22
• 1.4.4 BPI在中和肝素方面的应用22-23
• 1.4.5 BPI在抗血管生成方面的应用23
• 1.4.6 BPI对革兰阳性细菌L-型的杀灭作用23-24
• 1.5 本研究的目的意义24-25
• 2 材料25-29
• 2.1 实验材料25-26
• 2.1.1 实验菌株25
• 2.1.2 实验所需载体25
• 2.1.3 实验主要培养基25-26
• 2.1.4 实验主要试剂26
• 2.1.5 实验主要仪器26
• 2.2 实验主要溶液的配制方法26-29
• 2.2.1 实验中细菌培养液以及培养基的配制方法26-27
• 2.3.2 琼脂糖核酸电泳使用溶液的配制27
• 2.3.3 SDS-PAGE所需溶液的相关配制27-28
• 2.3.4 BPI-N蛋白纯化所需溶液的相关配制28-29
• 3 实验方法29-45
• 3.1 BPI-N目的基因的PCR扩增29-31
• 3.1.1 BPI-N目的基因的获取29
• 3.1.2 BPI-N目的基因扩增引物的设计29
• 3.1.3 BPI-N目的基因的PCR扩增29-30
• 3.1.4 BPI-N目的基因的凝胶回收30-31
• 3.2 pMD19-BPI-N重组载体质粒的构建31-35
• 3.2.1 大肠杆菌感受态细胞(DH5α)的制备31
• 3.2.2 重组子质粒的连接31-32
• 3.2.3 重组子质粒的转化32
• 3.2.4 重组载体的筛选32-33
• 3.2.5 重组载体的鉴定33-35
• 3.3 BPI-N目的基因的原核表达35-40
• 3.3.1 感受态细胞BL21(DE3)的制备35
• 3.3.2 pET-32a-BPI-N原核表达质粒的构建35-37
• 3.3.3 双酶切胶回收产物BPI-N目的基因37
• 3.3.4 双酶切胶回收pET-32a空载体37
• 3.3.5 目的基因BPI-N与pET-32a的连接37-38
• 3.3.6 目的基因BPI-N与pET-32a的转化38
• 3.3.7 重组子表达质粒pET-32a-BPI-N的筛选38
• 3.3.8 重组子表达质粒pET-32a-BPI-N的鉴定38-39
• 3.3.9 重组质粒pET-32a-BPI-N的原核表达39-40
• 3.4 重组宿主菌表达产物的检测40-43
• 3.4.1 重组宿主菌BL21(DE3)表达产物检测40-41
• 3.4.2 重组蛋白表达形式的判定41
• 3.4.3 BPI-N重组蛋白诱导时间以及IPTG浓度的优化41-42
• 3.4.4 BPI-N端融合蛋白的纯化42-43
• 3.4.5 BPI-N端融合蛋白的切割43
• 3.5 猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)的抑菌活性43-44
• 3.5.1 猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)对细菌抑制活性的测定43-44
• 3.6 猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)稳定性的研究44-45
• 3.6.1 热处理对BPI-N抑菌活性的影响44
• 3.6.2 不同的PH值对BPI-N抑菌活性的影响44
• 3.6.3 紫外光线照射对BPI-N抑菌活性的影响44-45
• 4 实验结果45-60
• 4.1 BPI-N端基因的克隆以及鉴定45-49
• 4.1.1 BPI-N端目的基因的获取(PCR扩增)45
• 4.1.2 pMD19-T-BPI-N端质粒的构建45
• 4.1.3 pMD19-T-BPI-N端质粒的鉴定45-47
• 4.1.4 pET-32a-BPI-N重组表达质粒的鉴定47-49
• 4.2 重组质粒pET-32a-BPI-N端的原核表达49-55
• 4.2.1 融合表达产物pET-32a-BPI-N的SDS-PAGE鉴定49-50
• 4.2.2 关于重组融合蛋白存在形式的判定50-51
• 4.2.3 对重组蛋白诱导时间、IPTG浓度的优化51-53
• 4.2.4 纯化重组融合蛋白53-54
• 4.2.5 重组融合蛋白的切割54-55
• 4.3 猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)对细菌抑制活性的检测55-57
• 4.4 猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)稳定性的研究57-60
• 4.4.1 热处理对猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)抑菌活性的影响57-58
• 4.4.2 紫外光照射对猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)抗菌活性的影响58-59
• 4.4.3 不同PH值的处理对猪源杀菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)抗菌活性的影响59-60
• 5 讨论60-62
• 5.1 外源基因融合表达的意义60-61
• 5.2 pET-32a-BPI-N重组蛋白的纯化以及切割61
• 5.3 对重组蛋白的抗菌活性以及稳定性的研究61-62
• 6 结论62-64
• 参考文献64-68
• 致谢68

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张道凌;梁剑平;崔颖;王学红;华兰英;;喹VA啉类药物抗肿瘤与抗菌活性的研究进展[J];中国兽药杂志;2008年04期

2 杨雪峰,陈永耀;乳过氧化物酶体系及其应用[J];河南职业技术师范学院学报;2004年01期

3 徐小雄;林海鹏;庄令;洪葵;;耐热小双孢菌212030的初步鉴定及抗菌活性评价[J];生物技术通报;2009年S1期

4 持田俊二;王玉珑;;日本蜂胶的化学成分和抗菌活性[J];中国养蜂;1989年05期

5 蓝江林;吴珍泉;周先治;林营志;;美洲大蠊血淋巴抗菌活性诱导差异比较[J];中国农学通报;2008年02期

6 玄红专,胡福良;过氧化氢与蜂蜜的抗菌活性[J];蜜蜂杂志;2002年09期

7 刘克武,杨守忠,葛绍荣,刘晓雯,闵丽娥,张斌,喻东,刘鑫;蜂王浆的抗菌活性研究[J];蜜蜂杂志;2001年02期

8 黄旭华;廖富，

本文编号：598910