猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导IL-10产生的分子基础研究

发布时间：2017-08-03 08:19

  本文关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导IL-10产生的分子基础研究

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的,以仔猪呼吸困难和母猪繁殖障碍为主要特征的一种传染病。2006年我国爆发了由HP-PRRSV引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征,给养猪业造成巨大经济损失。HP-PRRSV与经典PRRSV相比致病性和传播能力更强,引发机体产生的炎性反应和免疫抑制更严重。作为重要的免疫抑制因子与抗炎因子,IL-10在病毒介导的免疫抑制中起重要作用。多个研究结果显示PRRSV感染引起的对免疫系统的抑制与IL-10的表达水平密切相关。目前对PRRSV感染后诱导机体IL-10表达水平上调机制的研究还不深入,开展PRRSV诱导IL-10产生机制的研究有利于更深入的了解PRRSV感染产生免疫抑制的基础,为PRRS的防控提供有益的参考。实验室前期研究显示:强毒株HuN4及其传代致弱病毒HuN4-F112体内感染猪后,HuN4株能够诱发高水平的IL-10表达,而HuN4-F112感染后IL-10表达水平则很低。为研究PRRSV强弱毒感染后诱导IL-10产生的分子基础,我们首先对PRRSV HuN4株强弱毒体外感染PAM细胞诱导IL-10产生水平进行研究。实验结果显示:HuN4强弱毒感染PAM细胞后,诱导IL-10表达水平存在明显差异,HuN4感染后诱导高水平的IL-10表达,而HuN4-F112感染后IL-10表达水平很低。对调节IL-10产生的通路研究结果显示,HuN4强毒感染PAM细胞后与弱毒HuN4-F112相比能够诱导TLR2与TLR4转录水平上调,TLR7和TLR9转录水平下调,TLR3转录水平则无明显差异。对TLR下游的重要调节因子TRIF和MyD88转录水平检测结果显示:强毒感染PAM细胞后与弱毒HuN4-F112相比TRIF转录水平得到上调,MyD88转录水平差异不显著。对ERK与p38研究结果显示:强毒HuN4感染PAM细胞后能够持续上调p38磷酸化表达水平,而HuN4与HuN4-F112感染PAM细胞后ERK磷酸化水平无显著变化。本实验结果证实:PRRSV HuN4强弱毒感染PAM细胞后,诱导IL-10表达水平存在明显差异,强毒显著高于弱毒。强弱毒感染PAM细胞诱导IL-10表达水平的差异可能是由于强毒通过调控p38 MAPK磷酸化水平造成的。为了探寻PRRSV基因组上对IL-10表达具有调控作用的区域,我们首先利用实验室之前构建的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7、rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b和rHuN4-F112-ORF2-7在体外感染PAM细胞,结果显示PRRSV的非结构蛋白编码区ORF1a以及结构蛋白编码区能够显著影响IL-10的表达。利用反向遗传技术,将病毒nsp1、nsp2、nsp9-10和nsp9-11在强弱毒间进行互换,获得拯救病毒命名为rHuN4-F5-nsp1、rHuN4-F5-nsp2、rHuN4-F5-nsp9-1、rHuN4-F5-nsp9-11、rHuN4-F112-nsp1、rHuN4-F112-nsp2、rHuN4-F112-nsp9-10和rHuN4-F112-nsp9-11。将拯救嵌合病毒体外感染PAM细胞后,检测IL-10表达情况。结果显示:强毒替换弱毒nsp2编码区后,嵌合病毒诱导IL-10表达显著下降,弱毒替换强毒nsp2编码区后,嵌合病毒诱导IL-10表达水平显著上调。本实验结果证实PRRSV的非结构蛋白编码区nsp2可能在病毒体外感染PAM细胞诱导IL-10产生中起重要作用。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征病毒 IL-10 嵌合病毒 ORF1a nsp2
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）12
• 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）12-15
• 1.2.1 PRRSV的基因组构成12-13
• 1.2.2 PRRSV的非结构蛋白13-14
• 1.2.3 PRRSV的结构蛋白14
• 1.2.4 PRRSV的基因多样性14
• 1.2.5 PRRSV的复制机制14-15
• 1.3 PRRSV感染与先天性免疫应答15-17
• 1.3.1 Toll样受体信号15-16
• 1.3.2 PRRSV感染对先天性免疫应答的调节16-17
• 1.4 IL-10研究进展17-20
• 1.4.1 IL-10的生物学活性及功能17-20
• 1.4.2 PRRSV与IL-1020
• 1.5 研究目的与意义20-21
• 第二章 PRRSV HuN4株强弱毒体外诱导IL-10产生差异的分子基础研究21-31
• 2.1 材料和方法21-25
• 2.1.1 病毒和细胞21
• 2.1.2 试剂与仪器21-22
• 2.1.3 猪肺泡巨噬细胞（PAM）的获取22
• 2.1.4 病毒感染22
• 2.1.5 细胞总RNA的提取22-23
• 2.1.6 cDNA合成23
• 2.1.7 实时荧光定量PCR23
• 2.1.8 实时荧光定量RT-PCR检测PRRSV病毒含量23-24
• 2.1.9 ELISA检测IL-10蛋白24-25
• 2.1.10裂解细胞和Western blot分析25
• 2.2 结果25-29
• 2.2.1 PRRSV强弱毒感染PAM细胞后IL-10的表达存在明显差异25-27
• 2.2.2 PRRSV强弱毒感染PAM细胞复制水平存在明显差异27
• 2.2.3 PRRSV强弱毒感染PAM细胞TLR出现差异表达27-28
• 2.2.4 PRRSV强弱毒感染PAM细胞后对MyD88和TRIF的影响28-29
• 2.2.5 PRRSV强毒感染PAM细胞后激活p38 MAPK通路29
• 2.3 讨论29-31
• 第三章 PRRSV不同编码区对IL-10影响的研究31-43
• 3.1 材料与方法31-35
• 3.1.1 病毒和细胞31
• 3.1.2 试剂与仪器31
• 3.1.3 嵌合病毒构建策略31-33
• 3.1.4 嵌合病毒的拯救33-34
• 3.1.5 拯救嵌合病毒的鉴定34
• 3.1.6 拯救嵌合病毒的生长特性34
• 3.1.7 嵌合病毒对IL-10影响的初步研究34-35
• 3.2 结果35-40
• 3.2.1 全长嵌合cDNA质粒的线性化35
• 3.2.2 测序以及genomic marker的检测35
• 3.2.3 间接免疫荧光检测结果35-36
• 3.2.4 拯救嵌合病毒生长特性36-37
• 3.2.5 PRRSV大片段嵌合病毒感染PAM细胞后IL-10的表达存在差异37-38
• 3.2.6 PRRSV大片段嵌合病毒感染PAM细胞后复制水平存在差异38
• 3.2.7 PRRSV大片段嵌合病毒感染PAM细胞后p38磷酸化水平存在差异38-39
• 3.2.8 PRRSV非结构蛋白嵌合病毒感染PAM细胞后IL-10的表达存在差异39
• 3.2.9 PRRSV非结构蛋白嵌合病毒感染PAM细胞后复制水平存在差异39-40
• 3.2.10 PRRSV非结构蛋白嵌合病毒感染PAM细胞后p38磷酸化水平存在差异40
• 3.4 讨论40-43
• 第四章 全文总结43-44
• 参考文献44-55
• 致谢55-56
• 作者简历56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 韦天超;田志军;安同庆;周艳君;肖燕;姜一峰;郝晓芳;张善瑞;彭金美;仇华吉;童光志;;猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J];中国预防兽医学报;2008年12期

2 张善瑞;周艳君;朱建平;童武;姜一峰;童光志;;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定[J];中国预防兽医学报;2011年07期

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本文编号：613381